다형성 교모세포종에서 아데노바이러스 매개 antisense-VEGF를 이용한 유전자요법

Abstract

암은 치료의 발전에도 불구하고 이로 인한 사망율은 감소되고 있지 않아 새로운 개념의 항암치료의 개발이 필요하다. 발암 유전자(oncogene)나 종양억제 유전자(tumor suppressor gene)를 조작하는 방식의 유전자요법으로 항암 효과를 얻기 위해서는 대상 암종의 모든 세포의 유전적 변환을 유도해야 하는데 이 문제점을 극복하기 위해 종양의 성장에 필요한 신생혈관형성의 조절을 표적으로 한 치료가 종양치료의 한 방법으로 기여 할 수 있을 것으로 생각된다. 고형 종양의 지속적인 성장을 위해서는 신생혈관형성이 필수적이며 신생혈관의 형성정도는 전이빈도 및 환자의 예후와 관계가 있다. 종양 세포는 basic fibroblast growth factor(bFGF), vascular endothelial growth factor(VEGF)등의 신생혈관형성 촉진인자와 신생혈관형성 억제인자를 생성하여 이 과정에 참여한다. 여러 가지 신생혈관형성 촉진인자 중 신생혈관형성 및 종양의 성장에 VEGF가 가장 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 본 연구에서는 VEGF 과발현된 다형성 교모세포종에서 antisense -VEGF를 이용한 치료 모델을 고안하기로 하였다. Antisense-VEGF를 종양 내로 이입시키기 위해서는 적절한 운반 방법이 필요한데 유전자요법에 널리 이용되고 뇌조직을 포함한 여러 조직에 친화성이 있는 아데노바이러스를 매개로 한 방법으로 하였다. 다형성 교모세포종 세포주에서VEGF165에 대한 유전자를 antisense방향으로 가진 아데노바이러스 벡터(Ad5CMV- VEGF)를 이용한 신생혈관형성 억제치료를 시행하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 1. 다형성 교모세포종 세포주인 U-87 MG에서 아데노바이러스를 매개로 한 유전자 전달은 Ad5CMV- gal을 이용한 -gal assay상 20 MOI에서의 transduction efficiency는 75 ± 2.4 %였으며 MOI를 증가시킬수록 transduction efficiency가 증가하여 100 MOI 에서는 97 ± 1.5 %였다 2. Ad5CMV- VEGF를 처리한 U-87 MG세포에서의 내인성 VEGF mRNA의 down-regulation은 아데노바이러스 감염 후 3일에서 5일사이에 가장 현저하였으며 MOI를 증가시킴에 따라 VEGF mRNA 감소정도가 증가했다. 외인성 0.8 kb antisense VEGF mRNA는 Ad5CMV- VEGF로 감염시킨 세포에서만 검출되었으며 이는 Ad5CMV- VEGF가 세포내로 성공적으로 transduction되었음을 의미한다. 3. Ad5CMV- VEGF나 Ad5(dl312)로 처리한 세포주에서 secretory VEGF 단백질양의 측정을 위해 세포 배양액을 이용하여 ELISA를 시행하였다. Mock-감염 세포와 Ad5(dl312) 100 MOI로 처리한 세포를 배양하던 배양액내의 VEGF농도는 감염 6일 후 1451.7 ± 178.5 pg/ml/105 cells/24hr, 1468 ± 328.5 pg/ml/105 cells/24hr인데 반해 Ad5CMV- VEGF 100 MOI를 처리한 세포의 경우 888.7 ± 153.8 pg/ml/105 cells/24hr으로 상대적으로 감소되어 있었으며 Ad5CMV- VEGF 감염 후 9일에 secretory VEGF 단백질은 654.5 ± 18.2 pg/ml/105 cells/24hr으로 감소되었다. 그러나 세포 추출액에서 bFGF ELISA를 시행한 결과 bFGF의 발현은 억제되지 않았다. 4. Ad5CMV- VEGF로 감염시킨 U-87 MG 세포의 세포 배양액에서의 성장은 mock-감염세포나 Ad5(dl312)로 감염시킨 세포에 비해 감소되지 않았으며 각각의 population doubling level은 mock-감염세포, Ad5(dl312), Ad5CMV- VEGF로 감염시킨 세포에서 각 각 2.55, 2.62, 2.42로 차이가 없었다. 5. Nude mice에 U-87 MG 피하 종양을 만든 후 4일에 혈청을 함유하지 않은 배양액, 109 pfu의 Ad5CMV- VEGF나 Ad5(dl312)를 2일 간격으로 4회 종양내치료하였다. 4주후 종양의 크기는 혈청을 함유하지 않은 세포 배양액만으로 치료한 경우 977.2 ± 83.05 mm3, Ad5(dl312)로 치료한 경우 1475.6 ± 255.50 mm3인데 반해 Ad5CMV- VEGF로 치료한 군의 경우 236.3 ± 78.89 mm3로 의미 있게 대조군에 비해 낮았다(p=0.001). 6. 적출한 U-87 MG 피하 종양에서의 anti-VEGF 와 CD34 단클론 항체를 이용한 면역조직화학염색 검사상 Ad5CMV- VEGF치료군에서 Ad5(dl312)대조군에서보다 VEGF 발현이 감소되었고 미세혈관 수가 감소되어 있었다(p=0.01). 이상의 결과로 아데노바이러스를 매개로 한 antisense-VEGF 치료로 다형성 교모세포종 세포주인 U-87 MG에서 혈관 내피세포 성장인자의 mRNA 및 단백질의 생성을 감소시킬 수 있고 생체에서 종양의 성장 속도 감소 효과가 있어 신생혈관 형성의 조절을 표적으로 한 유전자요법이 종양 치료의 한 방법으로 기여 할 수 있을 가능성이 있다고 생각된다. ; New strategies are needed for the treatment of cancer. Among targets suitable for new therapies are regulator of angiogenesis. Angiogenesis modulators are important in tumor growth, as shown by the fact that neovascularization must occur for solid tumors to grow beyond a diameter of 2 to 3 mm. Glioblastoma multiforme is one of the most highly vascularized human cancers and vascular endothelial growth factor(VEGF) is a major positive effector of angiogenesis in this tumor. Inhibition of the endogenous VEGF expression by antisense VEGF sequence resulted in reduced vasculature and decreased tumor growth. The author has constructed a replication-deficient adenoviral vector containing the VEGF cDNA in an antisense orientation(Ad5CMV-αVEGF) to down-regulate VEGF expression and increase the in vivo applicability of antisense sequence. The effect of Ad5CMV-αVEGF on cell growth and VEGF expression was studied in vitro with human glioma cell line U-87 MG and tested in vivo efficacy with established subcutaneous U-87 MG tumors in nude mice. The results were as follows 1. According to -gal assay using Ad5CMV- gal, the transduction efficiency of human malignant glioma cell line U-87 MG was 75.2 % at 20 MOI, and the transduction efficiency increased with higher MOI and reached to 97% at 100 MOI. 2. VEGF expression increased with progressive growth of cells, but after Ad5CMV-αVEGF treatment at MOIs 25-400, endogenous VEGF mRNA expression was down-regulated and secretory VEGF protein was decreased upto 30-55% compared with Ad5(dl312)-treated control group. 3. Down-regulation of the other angiogenic factor, bFGF, was not observed after treated with Ad5CMV- VEGF, confirming that the Ad5CMV- VEGF effect is specific to VEGF. 4. The growth curve of U-87 MG cells treated with Ad5CMV- VEGF remained as same as that of mock-infected and Ad5(dl312)-infected U-87 MG cells, suggesting that Ad5CMV- VEGF does not have direct cytotoxic effect. 5. The growth of subcutaneous human glioma tumors established in nude mice was inhibited by early intratumoral injection of Ad5CMV- VEGF. 6. Immunohistochemical staining of subcutaneous tumors using anti-VEGF Ab and CD34 showed that VEGF secretion and mean microvessel counts were decreased in Ad5CMV- VEGF treatment group. In conclusion, the growth of subcutaneous human glioma tumors established in nude mice was inhibited by intratumoral injection of Ad5CMV- VEGF, demonstrated that efficient down-regulation of VEGF expression in glioma has an antitumor effect in vivo and Ad5CMV- VEGF is a feasible tool for antiangiogenic therapy in vivo.