HL-60 세포주의 분화 유도제 처리에 따른 표현형 및 기능 변화에 관한 연구

Abstract

HL-60 is a promyelocytic cell line which has been investigated as a model not only for leukemic cell biology but also for the myeloid differentiation during hematopoiesis. It is well known that DMSO(dimethyl sulfoxide) or retinoic acid induce granulocytic differentiation of HL-60 cells, while vitamin D or PMA(phorbol 12-myristate 13-acetate) in monocytic linage. It is also known that the expression of CD11b and CD18 on HL-60 cells increase during granulocytic differentiation. Fc receptors and CR3 play an important role in the protective response of granulocytes and monocytes against microbial infection. Fc receptors of IgG fall into three group, FcγRI(CD64), FcγRII(CD32), and FcγRIII(CD16), which opsonize phagocytosis, mediate ADCC and initiate oxidative burst, etc. CR3 (CD11b/CD18 or Mac-1), which binds iC3b, also stimulates phagocytosis. However, FcγRI, FcγRII, FcγRIII as well as CD11b/CD18 have never been measured in a quantitative way during hemopoiesis. Thus we quantified the expression of Fc RI, Fc RII, Fc RIII, and CD11b/CD18 during hematopoietic differentiation using HL-60 cells, which was induced to differentiate by DMSO, all-trans retinoic acid(ATRA), or PMA. In parallel with the phenotypic analysis, functional studies, such as phagocytic activity, respiratory burst and ADCC(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity) were performed. HL-60 cells(ATCC CCL-240), cultured in RPMI 1640 supplemented with 10% FBS, were induced to differentiate by adding 1.0% DMSO, 1μM ATRA or 16nM PMA. On the 4th and 7th day after stimulation as well as before stimulation, the cells were analyzed for phenotypic and functional differentiaton. Phenotypic analysis was performed by flow cytometry after staining the cells with PE-conjugated anti-human CD64, CD32, CD16, CD11b, CD18, and isotype controls, murine IgG_1/rat IgG_2b. And the measured fluorescent intensity was transformed into Molecules of Equivalent Soluble Fluorochromes(MESF). Phagocytic activity was also measured by flow cytometry after incubation of the cells with fluorochrome-conjugated beads. Respiratory burst was measured by chemiluminescence assay of 5x10^5 cells incubated with 250μM luminol after stimulation with 5mM PMA. ADCC was measured by hemoglobin release assay, using Rh+ type O erythrocytes sensitized with anti-D antibody as target cells. The results of phenotypic analysis showed that the expression of CD11b on HL-60 cells increased from 3,257±152MESF before stimulation to 16,613±1,984 on the 4th day and decreased to 9,285±354 on the 7th day by DMSO. ATRA induced similar change in the expression of CD11b. However, PMA did not increase the expression of CD11b. Expression of CD18 was increased from 66,475±2,371MESF to 172,972±19,003MESF on the 4th day after differentiation by DMSO and decreased to 67,140±2,872MESF on the 7th day. ATRA and PMA induced similar change in the expression of CD18. Expression of CD64 was increased to 17,696±2,164MESF on the 4th day and 23,012±2,701MESF on the 7th day by PMA. Expression of CD32 was already induced before differentiation induction and not increased by differentiation-inducing agents. CD16 on HL-60 cells was not expressed in spite of differentiation. The results of phagocytic assay showed that 53±1.9% of HL-60 cells phagocytosed the beads before stimulation. The phagocytic cell fraction did not increase by stimulation of the inducing agents rather decreased about 15-20%. The results of chemiluminescence showed the ATRA increased the respiratory burst of HL-60 cells on the 4th and 7th day by about 20-60 fold. DMSO increased the respiratory burst only about 4 fold, while PMA induced little increase. The results of ADCC showed that ATRA increased % target cell lysis continuously on the 4th and 7th day by about 2 fold. DMSO increased only on the 4th day by about 3 fold, but PMA did not. In summary, the quantitative expression of FcγRI, FcγRII, FcγRIII, and CD11b/CD18 of HL-60 cells was changed during induction of differentiation by DMSO, ATRA or PMA. And high expression of such receptors correlated to their enhanced phagocytic activity, respiratory burst and ADCC. ; 과립구나 단구는 세균이나 기생충 감염에 대한 방어기능을 담당하며, 이 과정에 세포 표면에 발현된 Fc 수용체와 CR3가 중요한 역할을 하게된다. Fc 수용체 중 Fcγ 수용체는 FcγRI(CD64), FcγRII(CD32), FcγRIII(CD16)의 세 종류가 알려져 있다. 이들은 탐식작용, 항체매개성 세포독성(ADCC), 사이토카인 등 매개물의 분비, 산화작용의 개시 및 항체 생산의 조절 등에 관여하는 것으로 알려져 있다. 보체 수용체의 일종인 CR3(CD11b/CD18 또는 Mac-1)는 백혈구와 내피세포의 부착에 관여하는 유착분자로 탐식작용을 항진시킨다. 그런데 현재까지 과립구나 단구의 조혈과정 중에 분화단계에 따른 FcγRI, FcβRII, FcγRIII나 CR3의 발현 정도를 정량적으로 연구한 보고는 없었고, 이들의 발현량과 각 세포의 기능과의 연관성도 알 수 없었다. 따라서 본 연구에서는 전골수세포 단계의 HL-60 세포주를 과립구로 분화시키는 dimethyl sulfoxide(DMSO), all-trans retinoic acid (ATRA)와 단구로 분화시키는 phorbol 12-myristate 13-acetate(PMA)를 첨가하여 배양하면서 분화에 따른 FcγRI, FcγRII, FcγRIII 및 CD11b/CD18의 발현 정도를 정량적으로 조사하고 아울러 이러한 분화과정 동안에 세포의 기능적 변화를 알아보고자 탐식능, respiratory burst 및 항체매개성 세포독성을 측정하였다. 연구방법은 HL-60(ATCC CCL-240) 세포를 10% 우태아혈청이 함유된 RPMI1640 배지에 5 x 10^5 cells/ml의 농도로 맞추어 각각 1.0% DMSO, 1μM all-trans retinoic acid 및 16nM PMA를 첨가하여 37℃, 5% CO_2 배양기에 배양하면서 분화유도전과 분화유도 후 4일 및 7일째에 세포의 표현형 분석 및 기능 시험을 시행하였다. 세포의 표현형 분석은 phycoerythrin(PE)이 부착된 anti-human CD64, anti-human CD32, anti-human CD16, anti-human CD11b, anti-human CD18 및 isotype control인 murine IgG_1/rat IgG_2b를 사용하여 형광염색을 시행한 후 유세포측정기로 분석하였다. 그리고 측정된 형광강도를 QuickCal Calibration/Compensation kit를 사용하여 Molecules of Equivalent Soluble Fluorochrome(MESF)로 환산하여 정량 측정하였다. 탐식능 분석은 형광물질이 부착된 bead를 첨가하여 세포를 37℃에서 1시간 진탕배양 후 유세포측정기로 탐식 세포의 분획을 조사하였다. Respiratory burst의 분석은 5 x 10^5 세포에 250μM luminol을 첨가한 후 5mM PMA로 자극시 chemiluminescence를 측정하였다. 항체매개성 세포독성은 본 연구 과정에서 고안된 hemoglobin release assay로 측정하였는데 Rh+ O 형 적혈구를 anti-D antibody (RhoGAM)로 감작시킨 표적세포를 실행세포와 반응시킨 후 적혈구의 용혈 정도를 측정하였다. 연구결과는 다음과 같았다. 1. HL-60 세포의 CD11b 발현량은 분화유도전에는 3,257±152 MESF에서 DMSO 처리후 4일째에는 16,613±1,984 MESF로 증가하였다가 7일째에는 9,285±354 MESF로 감소하였다. ATRA를 처리하였을 때에도 그 양상은 일치하였다. 그러나 PMA로 처리하였을 때에는 CD11b의 발현량은 증가하지 않았다. 2. CD18은 분화유도에 관계없이 99%의 세포에서 발현되었고 MESF 값은 DMSO, ATRA 및 PMA 모두에서 4일째 증가되었다가 7일째 감소하였다. 3. FcγRI(CD64)는 4일째 ATRA에 의해 가장 증가되었고, DMSO 및 PMA의 경우는 4일째 보다 7일째에 CD64를 더 많이 발현시켰다. 4. FcγRII(CD32)는 분화유도에 관계없이 90% 이상의 양성세포율을 보였고, 발현량도분화유도제 처리로 증가되지 않았다. 5. FcγRIII(CD16)은 분화유도전과 DMSO, ATRA 및 PMA에 의한 분화유도후 모든세포에서 발현되지 않았다. 6. HL-60 세포의 탐식능 분석의 결과는 분화유도전에는 53±1.9%의 세포가 bead를 탐식하였는데 탐식세포의 분획은 각종 분화유도제 처리에 의해 증가하지 않고 오히려 감소하였다. 7. Respiratory burst 분석을 위한 luminescence 측정의 결과는 ATRA로 분화유도 후 4일에서 7일째에 luminescence가 지속적으로 60배 이상 증가되었다. DMSO로 분화유도시킨 경우는 luminescence가 4배 정도 증가되었고, PMA의 경우는 거의 증가되지 않았다. 8. 항체매개성세포독성의 분석을 위한 Hemoglobin release assay의 결과 DMSO로 분화유도후 4일째 표적세포용해률이 3배 가량 증가되었다가 분화유도 7일째 감소되었고, ATRA의 경우는 분화유도후 7 일째에 2.5배가량 증가되었다. 그러나 PMA의 경우는 항체매개성 세포독성이 증가되지 않았다. 9. DMSO로 분화유도 시킨 경우 CR3 수용체인 CD11b와 CD18 발현이 서로 유의하게 증가하였고(r=0.84) CD11b와 CD18이 발현됨에 따라 항체매개성 세포독성이 증가하였다(r=0.96). 10. ATRA로 분화유도시킨 경우에서도 CD11b와 CD18의 발현이 서로 유의한 상관관계가 있었고(r=0.90), CD64와 CD11b(r=0.96) 및 CD18(r=0.89)의 발현에도 유의한 상관관계가 있었다. CD32의 발현에 따라 탐식능이 증가하였다 (r=0.91). Respiratory burst의 증가에 따라 항체매개성 세포독성도 증가양상을 보였다 (r=0.91). 이와같이 전골수단계의 HL-60 세포주는 분화유도제에 의하여 중성구와 단구로 분화되는 과정에서 각각 특이한 양상으로 Fc 수용체와 보체 수용체의 정량값의 변화를 나타내었으며, 이러한 세포표면 수용체들의 발현에 따라 탐식능, respiratory burst 및 항체매개성 세포독성 등의 기능분화가 이루어짐을 알 수 있었다.