RED analysis on familial psychoses group and cloning of CAG/CTG containing sequences from human genomic library : 유전성 정신 질환군에 대한 RED 분석 및 human genomic library로부터의 CAG/CTG를 포함하는 유전자의 클로닝

Abstract

사람의 신경정신질환을 일으키는데 관여하는 원인으로서 trinucleotide repeat (TNR) 서열이 발견되기 시작하면서 지난 10여년간 이와 관련된 많은 종류의 유전자들이 보고되었다. 이들 반복 서열들은 그 길이가 매우 불안정하게 다음 세대로 전달되며 길이가 증가할수록 병적 징후가 심각해지는 "유전적 예상효과 (genetic anticipation)"를 나타내는 것으로 알려져 있다. 여러 연구에서 이 TNR 서열을 바탕으로 한 유전자 hunting 기법을 발달시켰으며, 이중 Repeat Expansion Detection (RED)는 사람의 유전체 혹은 특정 유전자의 TNR 증가 정도를 알 수 있는 방법으로 각광을 받아왔다. 사람의 TNR 서열중 CAG/CTG 반복서열은 다른 TNR서열과는 달리 coding sequence 내에서 주로 발견되며 운동 실조증 (ataxia)을 일으킨다. 본 연구에서는 정상군, 운동실조군, 그리고 정신질환군으로 이루어진 세 그룹으로부터 사람의 유전체 내에 존재하는 CAG/CTG 반복서열에 대하여RED assay를 시행하여 그 증가 정도를 측정함으로써 세 그룹간에 차이가 있음을 증명하였다. 정상군의 CAG/CTG expansion pattern이 biallelic distribution을 보이는 반면 대조군으로 설정되었던 운동실조군에서는 이러한 분포가 관찰되지 않았으며, 실험군인 정신질환군에서는 두 대조군 사이의 중간 형태적 분포를 보이는 것으로 관찰되었다. 이것은 이들 반복서열로 인한 질환 유전자의 발굴에 있어 유전체가 갖는 가장 긴 CTG/CAG 확장정도가 중요한 것이 아니라 제한된 유전적 부위에서의 증가 양상이 핵심적인 사건이 됨을 시사하는 것이다. 또한 RED assay에 있어 기존에 사용되어왔던 방법을 간소화하여 primer 자체에 방사능 표지를 하여 보다 정확하고 빠르게 RED assay를 시행할 수 있도록 하였으며, 정확한 대조군 제작을 위하여 정확한 서열과 길이를 알고 있는 반복서열을 합성하는 방법을 제시하고 이들 서열들을 포함하는 플라즈미드들을 클로닝 하였다. 이들 서열의 제작 가능성은 여러 가지 진단용 탐침자 개발을 위한 유용한 방법을 제시한다. 여러 가지 CAG/CTG 반복서열을 포함하는 유전자들은 이들 반복서열들의 길이가 변화함으로써 비정상적인 단백질을 생산할 수 있으며 이들 유전자들의 이상행동은 세포내 독성을 높여 병적 징후를 유발할 수 있다. 따라서 이러한 유전자들의 pool을 확보하여 이들 서열들의 변화를 감시함으로써 규명되지 않은 유전자들의 기능을 밝히는데 도움이 될 수 있다. 이러한 노력의 일환으로 사람의 genomic library를 제작하여 CTG/CAG 서열로 스크린 하였으며 이들 클론들로부터 5가지의 CAG/CTG 반복서열을 포함하는 사람의 유전자 서열을 얻을 수 있었다. 얻어진 313, 461, 433, 394 bp와 292 bp 의 다섯 클론들 중 4종의 서열이 사람 유전자 내에 있는 것으로 보고된 것이었으며 한가지 서열은 아직 보고된바 없는 것이었다. 이들 반복서열들은 사람의 신경전달 물질인 dynorphin, human autoantigen, human papiloma virus regulatory factor유전자 및 아직 규명되지 않은 20번 염색체내 유전자 일부에서 보고된 바 있었으며 이들의 반복 서열중 아미노산으로 남는 경우 기존 신경퇴행성 질환들에서 보이는 폴리 글루타민 스트레치가 아닌 폴리 세린 혹은 폴리 알라닌 스트레치를 이루고 있었다. 이것은 폴리 알라닌 스트레치의 증가로 인한 Synpolydactyly (SPD)에서와 같은 형태의 질환을 일으킬 가능성이 있음을 시사하는 것이다. 또한 사람의 중요한 신경전달 물질로 작용하는 dynorphin 유전자의 경우 반복서열이 mRNA 상에 존재한다는 것은 비록 최종 단백질 산물에 아미노산으로 남지 않을 경우라도 이 유전자의 발현 조절에 중요한 영향을 미칠 수 있음을 암시하는 것이다. 사람의 유전체 서열이 모두 밝혀지고는 있으나 각 유전자의 기능 및 상호 관계에 대해서는 아직 많은 부분이 모호한 상태이다. Trinucleotide repeat sequence는 질병을 통해 유전자의 기능을 밝혀 줄 수 있는 좋은 시스템을 제공할 수 있으며 이들 반복서열들을 가지는 유전자의 변화를 조사함으로써 이들의 기능에 대한 더 많은 정보를 얻을 수 있을 것으로 생각된다. ; Since trinucleotide repeat (TNR) has been revealed as a main cause for human neurodegenerative disorder, many trinucleotide repeat containing genes have been found in a decade. These repetitive sequences are very unstable in genetic inheritance and the extent of a length is related with "genetic anticipation" that the longer expansion causes severer manifestation and earlier onset of a disease. Among 10 possible TNR sequences, long CAG/CTG sequences in human genome are main repetitive sequences found in coding sequences of ataxic genes. In many studies new techniques have been developed for hunting these TNR sequences. Among them Repeat Expansion Detection (RED) method has shown its availability in many application for TNR expansion detection. In this study we have developed the RED assay using radio-labeled primer, and introduced control repetitive template for this assay. Success in cloning of the stable long repetitive sequences suggests easier method for development of diagnostic hybridization probes or artificial clone for poly Q disease studies. Using the modified RED assay, lengths of CAG/CTG repetitive sequences have been detected in individuals from normal group, ataxic group, and familial psychoses group. The difference in length has been found in three groups; 80% of the normal individuals (40 subjects of the 50) revealed the length of 102bp or 204bp whereas only 5 subjects appeared on 153bp, the psychoses group showed the increase of the subject number between the two frequently detected lengths, and in ataxic group 89% of the subjects (17 subjects of 19) showed the length of 153bp and 204bp, which results in the break of the normal distribution. This means important factor in discovery of TNR disease gene is not the length of expansion but the expansion in specific loci. In order to search the causative locus to RED signal, genomic library screening was performed with CTG oligo sequences and five clones were obtained. Two of them were novel and registered to GenBank (AF213023 and AF213024). The former has not been identified yet, the latter was human papiloma virus regulatory factor. Rest of them are genes of human dynorphin, human autoantigen, and a part of chromosome 20 which has not known in the genetic function. In case of the CTG/CAG repetitive sequences translated, it is alanine stretch or several number of serine. It means the novel disease could be possible such as Synpolydactyly (SPD) caused by expansion of poly alanine stretch. Furthermore, the repetitive sequences in mRNA of human neuro - transmitter suggest a kind of possible regulation of the expression or processing although it does not remain as amino acids in protein. The whole sequences of human genome was discovered through many enthusiastic efforts. However, gene expressions, their functions, or their relationship has not been well known yet. Trinucleotide repeat sequence is suggested as the system which can clarify the gene function by certain type of disease. Therefore, using of the TNR system in examination of genetic function will be helpful to discover and identify new genes.