Identification and Functional Analysis of Nox4-binding Proteins

Abstract

Reactive oxygen species (ROS) are generally considered cytotoxic molecules which cause the oxidative damage to cellular components. Recently, several lines of evidence indicate that ROS might function as second messengers of cellular events such as ligand-induced signaling, regulation of cell growth, differentiation, apoptosis and motility. Several homologs (Nox1, Nox3, Nox4, Nox5, Duox1, and Duox2) of gp91phox (renamed Nox2) have been identified in various nonphagocytic cells. Although Nox isozymes may couple to distinct functions in different cell types, Nox4 is widespread expressed. Moreover, the regulation of Nox4 is far from clear. Goal of this study is to identify novel interacting protein in which may participate in the regulation of Nox4 enzymatic activity in terms of ROS generation. Yeast two hybridization and GST pull-down assay indicated that Grb2 binds to COOH-terminal region of Nox1 through its COOH-teminal SH3 domain. Overexpression of Grb2 protein resulted in decrease ROS generation in response to EGF. Knockdown of Grb2 by transfection of siRNA specific to Grb2 in HEK293T cells resulted in significantly increased ROS generation in response to EGF. These results indicate that Grb2 may act as a negatively regulatory role on EGF-dependent ROS generation. We also identified Nephrocystin 1 as an interacting protein with the COOH-terminal of Nox4. Nephrocystin interacts with Nox4 through their NH2-terminal region. Two isoforms of Nephrocystin 1 show different pattern of interaction with Nox4 by EGF-treatment. The full-length isoform (N1 4A) of Nephrocystin 1 requires EGF stimulation to interact with Nox4. However, the short isoform (N1 6A) binds to Nox4 in resting cells and the interaction was increased by EGF stimulation. Co-localization of Nephrocystin and Nox4 was confirmed with immunostaining assay. Overexpression of Nephrocystin had little effect on enzymatic activity of Nox4. The functional aspect of the interaction should be further studied.;활성산소종(Reactive oxygen species)은 다양한 외부자극에 의해 세포막에 위치하는 NAD(P)H oxidase라는 효소를 통해 생성되는 물질로 세포의 성장, 분화, 사멸 등의 조절에 있어서 중요한 이차신호전달 물질로 작용한다. 이러한 활성산소종의 생성 메커니즘은 Neutrophil, monocyte, macrophage와 같은 포식세포에 존재하는 NAD(P)H oxidase 2(Nox2, gp91phox) 의 연구를 통해 밝혀지게 되었다. 이 효소는 두 개의 막 단백질인 gp91phox와 p22phox와 세 개 이상의 세포질 단백질들(p67phox, p47phox, p40phox, Rac1 or 2)로 이루어져 있다. 외부자극이나 병원균의 침입에 의해 세포질 내에 존재하는 단백질들이 인산화효소에 의해 인산화되고 그것은 단백질들 사이의 결합을 유도한다. 그 결과 효소적 활성을 가지는 NAD(P)H Oxidase Complex가 형성되고, 이 complex를 통해 전자의 이동이 일어나 활성산소종이 생성된다. 이렇게 생성된 활성산소종은 포식세포의 면역과정에서 침입한 병원균을 포식세포 내로 함몰하여 죽이는 과정에서 중요한 역할을 하게 된다. NAD(P)H Oxidase Complex를 이루는 구성단백질에 유전적인 돌연변이가 발생했을 때 침입한 병원균을 효과적으로 제거할 수 없게 되고 이는 Chronic Granulomatous Disease (CGD)와 같은 병변상황을 유도한다는 사실은 활성산소종의 중요성을 뒷받침해준다. Nox2의 발견이래로 NAD(P)H oxidase에 대한 활발한 연구가 진행된 결과 포식세포뿐만 아니라 비포식세포에서도 Nox2의 다양한 유사체(Nox1, Nox3, Nox4, Nox5, Duox1, Duox2)가 존재함이 보고되었다. 이 유사체들은 구조상의 유사성에도 불구하고 발현되는 조직이나 효소 활성에 요구되는 보조인자의 종류, 생성하는 활성산소종의 양, 그리고 관련되는 생리학적인 기능 등에서 큰 차이를 보인다. Nox1은 colon조직 및 colon관련 암 세포에, Nox3의 경우는 kidney, liver, lung 등의 fetal tissue에 많이 발현되어 있다고 알려져 있다. 또한 Nox4는 kidney, smooth muscle cells, endothelial cells 등에 과발현되어 있어 있으며, Nox5는 lymphoid organs과 testis에 존재한다. Nox1의 경우 Nox2가 활성산소를 생성하는데 있어서 중요한 보조인자가 동일하게 작용한다는 것과 그 외에도 보조인자의 유사체 (p51phox, p41phox)가 존재하여 그 단백질들에 의해서도 Nox1의 효소활성이 조절된다고 보고되었다. 그러나 Nox4의 경우 Nox2와 Nox1의 활성산소 조절에 관여하는 보조인자 단백질들이 Nox4가 활성산소를 생성하는 과정에 관련되어지지 않는다고 보고 되었으며 그 조절기작이나 구체적인 기능 또한 거의 밝혀지지 않은 상태이다. 다만 보고된 것은 막 단백질인 p22phox가 Nox4가 함께 있을 때 활성산소가 생성되며 이렇게 생성된 활성산소가 노화, 파골 세포의 분화 및 기능조절에 관여한다는 것이다. Nox4 생화학적 기능을 더 깊이 이해하고 조절기전을 밝히기 위해 우리는 먼저 Yeast two hybrid system을 이용하여 Nox4와 결합하는 여러 가지 단백질들을 찾아내었고 그 중에 하나가 바로 “Grb2”라는 단백질이다. 이 단백질은 자체의 효소활성은 나타내지 않지만, 단백질 내의 다양한 결합부위를 통해 특정단백질들과 결합함으로써 signaling pathway를 연결해주는 adapter protein의 역할을 하는 것으로 잘 알려져 있다. 대표적인 예로 Grb2는 RTK의 특정 인산화 잔기에 붙는 동시에 Ras-GEF(Ras을 비활성형태인 GDP-Ras으로부터 활성화 형태인 GTP-Ras으로 바꾸는 단백질)인 SOS와 결합함으로써 Ras pathway를 활성 시킨다. 그러나 Grb2는 특정 signaling pathway를 활성 할 뿐 만 아니라 효소를 감쇄시키거나 억제하기도 한다. Grb2가 단백질 상의 결합부위들을 통해 다양한 signaling pathway에서 억제자로서 작용하는 예는 최근 들어 많이 보고되었다. 이러한 Grb2 단백질과 Nox4가 결합한다는 사실을 관찰한 후 Grb2가 나머지 Nox2 유사체들과도 결합하는지를 정하기 위해 yeast two hybrid assay를 수행하였는데 흥미롭게도 Grb2는 Nox4뿐만 아니라 Nox1과도 결합한다는 결과를 얻을 수 있었다. Nox family에 속하는 단백질들 중 Nox4와 가장 큰 sequence 유사성을 보이는 Nox1이 Grb2와 비슷한 결합경향을 보인 것이다. 이러한 결과는 in vitro GST pull-down assay를 통해 재차 확인할 수 있었으며, 이 결합의 일부가 활성산소종의 생성을 유도하는 것으로 알려진 성자인자 중 하나인 EGF 자극에 의해 깨지는 것을 관찰 할 수 있었다. 또한 Grb2는 앞서 언급한 Nox1의 보조인자 단백질 중 p47phox와 그것의 유사체인 NoxO1과도 결합하는 것을 보았다. 이러한 Grb2와 NADPH oxidase안의 다양한 단백질들 사이의 물리적인 결합이 NADPH oxidase complex의 효소 활성에 미치는 영향을 알아보기 위해 우리는 Grb2를 과발현 시키거나 혹은 발현을 억제시킨 상태에서의 활성산소종의 생성을 각각 측정해보았다. 그 결과 Grb2가 과발현 되어있을 때, 성장인자에 의해 유도되는 Nox1의 활성산소종 생성이 저해되며 그 반대로 Grb2의 발현을 저해한 경우 활성산소종의 생성이 증가되는 것을 보았다. Grb2의 Nox1의 효소활성에 미치는 영향과 Grb2와 Nox1, p47phox, NoxO1가 결합하는 결과를 종합하여 볼 때 Grb2가 외부자극에 의한 NADPH oxidase complex의 온전한 형성을 방해함으로써 활성산소종의 생성을 조절한다고 예상된다. 두 번째로 다루고자 하는 Nox4결합 단백질은 그 단백질을 암호화하는 유전자에 돌연변이가 생겼을 경우 어린이의 신장기능장애를 유발하는 것으로 알려진 Nephrocystin 1이다. Nox4가 그러하듯 Nephrocystin1 단백질 또한 그 기능과 조절기전이 거의 밝혀져 있지 않은 상태이다. Nephrocystin1단백질 상에는 단백질-단백질 결합에 관여하는 다양한 영역이 존재하며, 그 중 SH3 domain과 coiled-coil region을 포함하는 아미노산 말단 부위를 통해 Nox4와 결합하는 것을 확인하였다. 또한 in vitro binding assay를 통해 Nephrocystin1의 크기가 다른 두 가지 유사체가 각각 EGF자극에 의해 다른 경향으로 Nox4와 결합하는 것을 관찰하였으며, 이 실험결과는 immunostaining assay를 통해 in vivo 상태에서도 재확인되었다. 위의 결과들을 통해서 NADPH oxidase와 결합하는 새로운 단백질과 그 단백질을 통한 새로운 ROS생성 조절 메커니즘을 알 수 있었다. 또한 Nox4가 기능이 알려져 있지 않은 새로운 단백질과 결합한다는 결과를 통해 Nox4의 밝혀지지 않은 새로운 기능의 존재 가능성을 예상할 수 있었다.