나환자 피부병변의 파라핀 포매조직에서 TNFa발현에 관한 연구

Abstract

Tumor necrosis factor alpha (TNFa) plays various roles in the pathogenesis of leprosy. It has been reported that TNFa promotes granuloma formation, inhibits mycobacterial growth by enhancing the production of nitric oxide in the macrophage, induces tissue and nerve damage in high concentration, and so on. Expression of TNFa according to the clinical type of leprosy has been studied in the patient serum, stimulated PBMC, and the skin lesions, but these result were controversial. Also, all studies of the skin lesions have been limited because of small number of frozen tissues. The purposes of this study were to estimate the availability of paraffin-embedded skin tissue of leprosy for the detection of TNFa mRNA and protein, to analysis the TNFa expression according to the clinical types of leprosy and lepra reaction, and to demonstrate various TNFa-positive cell in the skin lesion. In the paraffin-embedded skin tissues of 17 new cases of leprosy, TNFa mRNA expression was detected by using in situ hybridization with digoxigenin labelled oligonucleotide probe cocktail and TNFa protein expression by using immunohistochemical stain. In addition, serum TNFa level was estimated by using ELISA for the evaluation of relationship between before and after lepra reaction. The results are followings: 1. The density of TNFa mRNA-positive cells ranged from 8 to 26 percent (mean 17 percent) and that of TNFa protein-positive cells ranged from 3 to 8 percent (mean 7 percent). They were highest in borderline lepromatous leprosy lesions. The density of TNFa-positive cells was significantly higher by using in situ hybridization than by using immunohistochemical stain. 2. The TNFa-positive cells in paraffin-embedded skin lesion were CD8 positive cells, CD68 positive cells, endothelial cells, histiocytes, Schwann cells, and keratinocytes. The number of these cells before leprosy treatment was not significantly different from that after leprosy treatment. 3. The density of CD8-positive cells was significantly higher in lesions without lepra reaction than in lesion with lepra reaction, and that of CD68-positive cells was significantly higher in lepromatous leprosy lesion than in borderline lepromatous leprosy lesions. 4. Serum TNFa level was higher during lepra reaction than before lepra reaction and the high level continued even after resolution of lepra reaction. In conclusion, It suggested that the paraffin-embedded tissue in leprosy is a very effective and available material for detecting expression of TNFa mRNA and protein by using in situ hybridization and immunohistochemical stain. Also, in situ hybridization was more sensitive than immunohistochemical stain. The number of TNFa-positive cells was highest in borderline lepromatous leprosy lesions. With further refinement, this may be a new application of study for TNFa expression in leprosy. ; Tumor necrosis factor alpha(TNFa)는 농도에 따라 다양한 생물학적 작용을 나타내는 cytokine으로 소량 및 생리적 농도에서는 백혈구와 상피세포에 조절기능을 나타내어 효율적인 염증반응을 유발시켜 숙주를 보호하나 다량의 농도에서는 오히려 숙주에 해로운 영향을 미치는 양면성을 가지고 있다. 미코박테리움 감염(mycobacterial infection)에서도 TNFa는 육아종을 형성하고 대식세포에서의 산화질소(nitric oxide)생성을 증가시켜 미코박테리움의 성장을 억제하여 숙주 방어기전에 기여하는 반면 국소 조직손상 및 신경손상에도 관여한다. 나병환자에서의 TNFa는 혈청, 나균에 의해 자극된 말초혈액 림프구, 또는 피부병변의 조직 등에서 발현됨이 여러 차례 보고되었으나 병형에 따라 다소 상반되는 결과를 보였다. 특히 피부병변의 조직에서 발현을 관찰한 보고들은 모두 냉동조직 절편을 이용하여 면역조직화학 염색 도는 in situ hybridization을 시행한 것으로 표본수가 작아서 제한된 연구에 그쳤다. 따라서 냉동조직 대신 파라핀 포매조직을 이용할 수 있다면 다양한 연구를 수행할 수 있을 것이다. 본 연구의 목적은 나환자의 피부병변 파라핀 포매조직을 이용한 TNFa단백 및 mRNA발현의 가능성 여부를 알아보기 위해 면역조직화학 염색과 in situ hybridization을 시행하여 그 결과를 분석하고 병변에서 TNFa발현을 보이는 세포의 종류들을 관찰하고자 하였다. 연구재료는 17명의 신환 나환자의 피부병변 파라핀 포매조직을 이용하였다. TNFa mRNA발현세포를 보기위한 in situ hybridization은 조직을 탈파라핀한 후 3개의 gigoxigenin으로 표지된 DNA antisense oligonucleotides를 소식자(probe)로 사용하여 시행하였다. TNFa 단백 발현세포를 보기 위한 면역조직화학 염색은 1차로 TNFa단백에 대한 2차로 CD8와 CD68에 대한 단클론 항체를 사용하여 이중 염색(double stain)방법으로 시행하였다. TNFa발현정도의 평가는 400개 이상의 세포에 대한 양성세포 수를 백분율로 나타내었다. 그리고 나반응 전 , 나반응 동안 및 소실 후에 혈청 채혈이 가능하였던 4 명의 환자에서 ELISA법을 이용하여 혈청내 TNFa의 양을 측정하고 비교하였다. 그 결과는 다음과 같다. 1. 나병 피부병변의 파라핀 포매조직에서 TNFa mRNA 양성세포의 발현율은 8.0-26.1%(평균 17.5%), TNFa단백 양성세포의 발현율은 3.2-8.3%(평균 7.0%)로서, TNFa 단백 양성세포가 in situ hybridization에서 면역조직화학 염색보다 유의하게 많은 수로 관찰되었다. 두 검사방법에서 모두 근나종나 병변에서 가장 높은 발현율을 보였다. 2. 면역조직화학 염색에서 TNFa 단백 양성세포로서 CD8 및 CD68 양성세포, 혈관내피세포, 조직구, 슈반세포 및 각질형성세포 들이 관찰되었고, 나병치로전후의 TNFa 단백 양성세포 전체 수의 변화는 통계적으로 유의한 차이가 없었다. 3. CD8 양성세포는 나반응이 없는 병변에서 나반응이 있는 병변보다 유의하게 많았고, CD68 양성세포는 나종나 병변에서 근나종나 병변에 비하여 유의하게 많았다. 4. 혈청내 TNFa 양은 나반응 전에 비하여 나반응 동안에 증가되었고 나반응 소실후에도 증가된 상태가 지속되었다. 이상의 결과, 피부병변 파라핀 포매조직을 이용한 TNFa mRNA와 단백발현은 냉동조직을 이용한 경우보다 월등한 발현율을 보여 파라핀 포매조직이 매우 유용한 재료임을 알 수 있었고, in situ hybridization법이 면역조직 화학 염색법에 비하여 TNFa 발현을 더 세밀하게 관찰할 수 있다는 것을 알 수 있었다. 또한 기존 보고와는 달리 근나종나의 병변에서 TNFa mRNA와 단백이 가장 높은 발현율을 보임으로써 앞으로 보다 많은 표본을 통한 다양한 연구가 필요할 것으로 생각된다.