대장암 조직에서 survivin의 발현에 관한 연구

Abstract

세포자멸사는 조직의 발달과 기관의 형성에 필수적인 기전이다. 이 과정이 억제되면 세포의 생명주기가 연장되므로 돌연변이가 있거나 비정상적인 형태를 가진 세포의 축적을 유도하여 암종을 발생시키고 항암제에 대한 세포의 저항성을 증가 시킨다고 알려져 있다. Survivin은 최근에 밝혀진 IAP군(Inhibitor of Apoptosis family)으로서 세포자멸사를 억제하는 효과를 내는 것으로 알려져 있으며 이 유전자는 염색체 17q25에 위치한다. Survivin은 태생기에는 발현되나 정상적인 상인의 조직에서는 발현되지 않으며 여러 종류의 암종이나 변형이 일어난 세포에서만 발현되는 유전자로 그 전사 단백질은 16.5kDa이다. 여러 암종에서 survivin의 단백질의 존재에 대한 연구가 시작되고 있으나 아직도 그 역할이나 조절기전에 대해서는 거의 알려진 바가 없다. 이에 따라 인간의 대장암 조직에서 survivin의 유전자가 실제로 발현하고 있는지 확인하고 기존에 알려진 세포자멸사의 최종 효과자인 caspase 3와 그 기질인 PARP와 survivin과의 연관성을 알아보고자 본 연구를 실시하였다. 양성 대조군은 survivin 발현이 확인되었던 HL60, Daudi, THP1 md의 세포주와 그외 COLO 201, ZR-75-1, WiDr 등의 세포주를 이용하였고 음성 대조군은 정상 대장 조직 6개를 대상으로 하였다. 대장암 36예의 수술 환자의 냉동조직에서 RNA를 추출하여 survivin과 caspase 3에 대한 역전사 연쇄중합효소반응을 실시하였다. 파라핀 포매조직의 확보가 가능하였던 20예의 대장암 조직에서 caspase 3와 PARP에 대한 면역조직화학 염색을 실시하여 그 발현도를 양성과 음성으로 구분하였다. 또, caspase 3에 대한 웨스턴 영동을 실시하여 각 조직에서 caspase 3의 단백질 발현이 어느정도인지 확인하고자 하였다. 역전사 중합효소반응 결과 survivin은 36예의 대장암 조직 중 22예(61.1%), caspase 3는 27예(75%)에서 양성이었다. 면역조직화학 염색의 결과 caspase 3, PARPdml 경우 각각 13예(65%), 17예(85%)에서 정상에 비해 발현도가 저하되었거나 소실되어 있었다. 웨스턴 영동의 결과 정상 대장조직과 암조직에서 모두 32kDa의 비활성형의 띠를 확인할 수 있었으며 암조직의 경우 16예(80%)에서 정상조직보다 과발현되어 있었다. 임상, 병리 소견과 survivin의 발현도를 비교한 결과 통계적인 의의가 없었으며 caspase 3, PARPdml 발현도와도 유의한 차이가 없었다. 본 연구의 결과 대장암 조직에서 survivin은 61.1%의 매우 높은 비율로 발현되고 있음을 알 수 있었고 이는 대장암에서 세포자멸사가 억제되어 있으며 이 과정에 survivin이 작용하고 있을 가능성을 시사하는 소견이다. Caspase 3는 대표적인 세포자멸사의 최종 효과자이고 세포자멸사가 진행되면 32kDa의 비활성형이 분리되어 활성형으로 변화하는것으로 알려져 있으며 caspase의 활성도는 단백질단계에서 결정되므로 웨스턴 영동의 결과가 더 정확하다. 웨스턴 영동의 결과 암조직에서 caspase 3에 대한 비활성형의 따가 두렷하게 과발현되는 것을 확인할 수 있었으나 이 결과와 survivine의 발현여부와의 관련성은 없었다. 기존의 연구 결과와 같이 caspase 3은 불활성 형태로 존재하여 대장암 조직에서 세포자멸사가 감소되어 있는 것으로 생각되고, 암조직에서 세포자멸사 억제인자인 survivin의 mRNA가 비정상적으로 발현되고 있는 것으로 보아 survivne이 암종에서의 mRNA가 비정상적으로 발현되고 있는 것으로 보아 survivine이 암종에서의 세포자멸사 억제기전에 작용하는 것으로 보이며 추후 심도있는 연구가 필요할 것으로 생각된다. ; Apoptosis is a programmed cell death that is essential step for tissue development and morphogenesis of organs. When apoptosis is suppressed, the cell life span is delayed, thus accumulation of genetic mutation is induced resulting in the development of neoplasm. Survivin, the recently discovered apoptosis inhibitor of IAP family, is located in chromosome 17q25. It is found only in fetal tissue and transformed tissue but never found in normal adult tissue. Several authors reported survivin expression in various cancer tissues, that suggested the role of survivin in cancer development. In this study, the author intended to find the degree of survivin expression and caspase 3 that is the know substances related to apoptosis using the RT-PCR technology. That the cell lines were known to have survivin expression such as HL60, Daudi, THP1, COLO 201, ZR-75-1 and WiDr were used for the positive control. For the negative control, normal colon tissues were included. The total RNAs from the frozen tissue of 6 normal colon, 36 specimens of colorectal cancer and cell lines were used in RT-PCR. After the primers for survivin and caspase 3 were produced, PCR amplification was done by thermal cycler. Next, the 20 paraffin embedded tissues among the above patients were used in immunohistochemical study to find out the degree of protein expression of caspase 3 and PARP. The results were interpreted in either positive or negative. Using same tissues, western blotting was conducted for caspase 3 as usual manners. The expression rates of survivin were compared with the result of the immunohistochemical staining, western blotting of caspase 3 and PARP. The survivin expression by RT-PCR techniques was found at the 22 cases(61.1%). As a result of the immunohistochemical staining, 13 cases(65%) in caspase 3, 17 cases(85%) in PARP showed reduced staining. In western blotting, 32kDa inactive form of caspase 3 was expressed in 16 cases(80%), but band of active split form was not found. No significant relationship was found between survivin expression and clinicopathologic datas of colorectal carcinoma or expression of caspase 3 and PARP. In conclusion, survivin is expressed highly in mRNA level and caspase 3 protein is reduced and its inactive form is overexpressed in human colorectal cancer tissues. These result suggest that apoptosis mechanism is depressed in colorectal cancer tissues and survivin plays a role in the inhibition of apoptosis of colorectal cancer. More profound study will be needed in this field so that the apoptosis mechanism in tumorigenesis can be confirmed.