복합 및 유격배양한 섬유모세포가 마우스 두개관 미분화간엽세포의 골세포 분화에 미치는 영향

Abstract

골수에서 얻은 골형성세포를 배양하여 이를 직접 혹은 운반체나 성장인자와 함께 이식하여 골재생을 유도하는 생체조직공학에 관한 많은 연구가 이루어지고 있다. 배양세포의 이식을 통한 골재생 방법 뿐 아니라 골재생을 위해 시도되는 다양한 이식재의 성공적인 골유도를 위해서는 치유과정에서 세포 및 세포외 기질을 포함하는 기존 주위조직과의 상호작용에 대한 폭넓은 이해와 고려가 요구된다. 실험실에서 배양한 골수 세포를 생체 내에 이식하여 골모세포의 분화, 석회화 및 골양조직이 형성됨이 알려져 있으나, 골형성과정에서 조직에 존재하는 특정 세포나 세포외 기질과의 상호작용에 대하여는 알려져 있지 않다. 이에 본 연구의 목적은 골모세포와 섬유모세포의 단층복합배양 및 유격배양을 통하여 섬유모세포가 골모세포의 분화에 미치는 영향을 알아보고 결합조직상부에 골모세포를 이식한 후 배양하여 골형성 여부와 그 정도를 관찰함으로써 섬유모세포 및 결합조직이 골모세포의 분화에 미치는 영향을 구명하고자 하였다. 골모세포와 섬유모세포의 세포수와 복합배양하는 시기를 달리한 단층세포배양에서 염기성 인산분해효소의 활성도를 측정하였고, 배양세포군을 Von Kossa 염색하여 영상분석기로 석회화된 골결절의 밀도를 측정하였다. 배양된 섬유모세포가 생성하여 분비하는 용해성 성장인자나 cytokine이 골모세포 분화시기에 미치는 영향을 알아보기 위해서는 골모세포와 섬유모세포를 Transwell 을 통해 유격배양하여 염기성 인산분해효소의 활성도와 석회화된 골결절의 밀도를 측정하였다. 또한 결합조직 상부에 골모세포를 점적한 결합조직 실험군과 골모세포를 점적하지 않은 결합조직 대조군을 배양한 후 조직 절편을 Von Kossa 와 Trichrome Goldner 방법으로 염색하고 광학현미경으로 관찰하여 다음과 같은 결론을 얻었다. 1. 섬유모세포와 골모세포를 단층세포배양한 상태에서는 골모세포의 성숙기가 연장되고 석회화가 지연되었다. 2. 섬유모세포를 골모세포의 증식기에 유격배양하면 골모세포 증식이 촉진되고 염기성 인산분해효소의 활성도와 골결절의 석회화가 증가하는 경향을 보였다. 3. 섬유모세포를 골모세포의 석회화기에 유격배양하면 골결절의 석회화가 감소되고 석회화가 지연되는 경향을 보였다. 4. 3차원 결합조직상에 골모세포를 이식하면 결합조직내에서 골모세포가 증식하여 교원질 기질이 형성되고 석회화가 나타났다. 이와 같은 결과는 증식 속도의 차이와 접촉억제가 있는 조건에서는 섬유모세포가 골모세포의 분화를 지연시키지만 증식 속도의 차이와 접촉억제요인을 배제한 유격배양에서는 섬유모세포가 골모세포의 분화시기에 따라 다르게 작용하는데, 즉 골모세포 증식기에는 석회화를 증가시키고 골모세포 석회화기에는 석회화를 지연시킨다고 해석된다. 섬유모세포에 의해 분비되어 골모세포 분화단계에 영향을 미치는 성장인자 등의 물질에 대한 연구가 더 필요하리라 사료된다. ; This study was designed to evaluate the influence of fibroblasts or connective tissue from mouse oral mucosa on differentiation of neonatal mouse calvaria-derived osteoblasts and mineralization of bone nodules. Primary cell cultures from mouse calvarial osteoblasts and 2-4 passaged fibroblasts from oral mucosa were co-cultured in monolayer cultures, devided into 6 experimental group according to cell density or cell confluency. Osteoblasts were also co-cultured with fibroblasts in Transwell culture plate with different co-cultured period according to osteoblast differentiation. The alkaline phosphatase activity were measured in monolayer cultures and cultures using Transwell . The mineralized bone nodules were presented by Von Kossa staining and density of mineralized nodules was measured by image analysis. The connective tissues with or without osteoblast seeding were cultured and examined histologically by Von Kossa and Trichrome Goldner staining. The results were as follows; 1. Prolonged maturation of matrix and delayed mineralization of bone nodules were resulted in monolayer cultures. 2. Co-culture of fibroblast with osteoblast using Transwell during osteoblast proliferation stage stimulated proliferation of osteoblasts and increased alkaline phosphatase activity and mineralization of bone nodules. 3. Co-culture of fibroblast with osteoblast using Transwell during matrix mineralization stage decreased and delayed mineralization of bone nodules. 4. In vitro cultured connective tissue with osteoblast seeding resulted in proliferation of osteoblasts and matrix formation with mineralization.