Molecular Cloning and Characterization of a Serine protease-like protein from silkworm (Bombyx mori)

Abstract

곤충의 immune system에 관한 연구는 고등동물의 immune system의 기원을 밝힌다는 측면에서 많은 연구자들에게 주목을 받아왔다. 특히 곤충이 고등동물이 지닌 면역인자와 유사한 생체활성물질을 가지고 있다는 사실이 밝혀지면서 이 분야의 연구가 더욱 활발하게 수행되어져 왔다. 이에 항균성단백질은 기존의 항생제들을 대체할 수 있는 새로운 생체면역활성인자로서 활발히 연구되어지고 있다. 곤충의 대표적 항균성 단백질에는 cecropins, defensins, attacin-like (glycine-rich) proteins, proline-rich proteins과 lysozyme 등이 이미 밝혀져 있다. 최근 연구에서 serine protease 또는 그것과 유사한 구조를 지닌 단백질이 antibacterial activity를 가지기도 하는 것으로 밝혀졌는데, 이들은 serprocidin family라고 불리우며, 사람의 azurocidin과 투구게의 factor D, serprocidins과 cathepsin G, elastase, protease-3 그리고 azurocidin등이 이에 속한다. 이 실험에서는 computer search를 통해 “SilkBase” (Bombyx mori Gemone project)에서 Trichoplusia ni의 azurocidin-like protein과 유사한, 양 말단이 부분적으로 일치하는 두 개의 cDNA fragments를 찾아냈으며, RT-PCR을 통해 cloning하였다. RT-PCR 결과 획득한 946bp fragment (BmSp; GenBank DQ118520)는 303개의 amino acids를 encoding하고 있었으며, Sarcophaga peregrina 의 26-kDa serine protease와 43%의 유사성을 보였다. 그리고 BmSp는 serine protease의 촉매활성을 특징짓는 활성부위에 존재하는 3개의 아미노산(His^(41)/Asp^(88)/Ser^(185))을 가지며, 6개의 conserved cysteine residues가 3개의 bonds를 이루고 있는데 이것은 무척추동물의 serine protease의 특징이라고 할 수 있다. 특히 Asp179/Gly207/gly217은 trypsin substrate specificity sites이며, A.gambiae의 seine protease (AGSP6A; GenBank Z49815)와 45%의 유사성을 나타냈다. 이러한 근거들은 BmSp가 serine protease의 한 member인 trypsin일 가능성을 제시해 준다. 이러한 구조적 유사성을 바탕으로 pGEX-5X-1에 cloning하고 purification한 후 GST-BmSp fusion protein으로 antibacterial activity test를 해보았으나, 항균성을 보이지 않았다. 아직까지 serine proteases나 그것과 구조적으로 유사한 proteins이 어떠한 구조상의 특징으로 antibacterial activity를 가지게 되는지에 대해서는 밝혀지지 않았다. 단지, antibacterial activity가 protease의 catalytic activity와는 무관하다는 것과, catalytic position에서의 substitution, 77-83에 위치하는 hepta-peptide 그리고 clip domain이 antibacterial activity와 연관이 있을 것이라는 추측들만이 거론되어 있을 뿐이다. 비록 이번 실험에서 BmSp가 항균성을 나타내진 않았지만, proteolytic activity test와 함께 characterization을 통해 trypsin임을 확인한다면 더욱 의미있는 결과가 도출될 것으로 기대된다. 또한, 누에에서 발현되는 새로운 항균성단백질에 대한 연구와 함께 serine protease와 항균성과의 구체적인 관계에 대한 연구도 진행되어야 할 것으로 생각된다.;The Bombyx mori BmSp coding region was assembled from two separate and overlapping cDNA fragments. Fragments encoding the complete open reading frame middle portion were found in the Bombyx mori Genome project “SilkBase” collection through sequence homology with Trichoplusia ni azurocidin. Sequencing analysis of the BmSp revealed the presence of an open reading frame of 909bp, which encodes 303 amino acids. The mature BmSp protein shows 43% identity to Sarcophagi peregrine 26-kDa protease, an antibacterial protein. The BmSp sequence have low but recognizable sequence similarity to members of the serine proteases. The deduced amino acid sequence of BmSp was most similar to A. gambiae serine protease (AGSP6A) with 45%. Typical features of the BmSp from B. mori included the serine protease active site triad His/Asp/ Ser, three pairs of cysteine residues for disulfide bridges, and three residues, Asp/Gly/Gly , that help to confer trypsin-like specificity to the enzymes. Using RT-PCR and enzyme digestion, the full encoding sequence for BmSp was cloned into the E .coli expression vector pGEX-5X-1. The fusion protein GST-BmSp was effectively expressed in E. coli BL21(DE3)pLysS as inclusion bodies and a denaturation and refolding procedure was performed to obtain bioactive soluble GST-BmSp. The recombinant protein was purified and antibacterial activity test against Gram-positive, Gram-negative bacteria. Different from the other protein, further studies are necessary to prove the structure and what affect the antibacterial protein.