Activity assay of mammalian 2-Cys Peroxiredoxins using yeast thioredoxin reductase system

Abstract

2-Cys peroxiredoxin (Prx) is a novel cellular peroxidase that reduces peroxides in the presence of thioredoxin, thioredoxin reductase, and nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) and that functions in H₂O₂-mediated signal transduction. Recent studies have shown that 2-cys Prx can be inactivated by cysteine overoxidation in conditions of oxidative stress. Therefore, peroxidase activity, rather than the protein level, of 2-cys Prx is the more important measure to predict its cellular function. In the present study, I introduce a modified activity assay method for mammalian 2-cys Prx based on yeast nonselenium thioredoxin reductase. Yeast thioredoxin reductase is expressed in Escherichia coli cells and purified at high yield (40 mg/L of culture broth) as an active flavoprotein by combined diethyl aminoethyl (DEAE) and phenyl hydrophobic chromatography. The optimal concentrations of yeast thioredoxin and thioredoxin reductase required to achieve maximum mammalian 2-cys Prx activity are 3.0 and 1.5 μM, respectively. This modified assay method is useful for measuring 2-cys Prx activity in cell lysates and can also be adapted for a 96-well plate reader for high-throughput screening of chemical compounds that target 2-cys Prx.;2-Cys peroxiredoxin (Prx)는 새로운 세포내 peroxidase로서 Thioredoxin, Thioredoxin reducatase와 Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate(NADPH)를 이용하여 perosxide를 감소 시키거나 H₂O₂에 의한 신호전달에 관여한다. 최근 연구에서는 2-cys Peroxiredoxin이 산화적 스트레스 상태에서 활성부위에 있는cystein의 과도한 산화로 인해 활성을 잃게 된다는 것이 알려졌다. 그러므로, 세포내에서의 peroxiredoxin의 기능을 예측하기에는 2-cys Peroxiredoxin의 발현량보다 Peroxidase의 활성도를 측정하는 것이 더 중요하다. mammalian peroxiredoxin의 활성을 측정할때는 reduction system으로서 이용되는 thiredoxin reductase, thiredoxin와 electron donor인 NADPH가 필요하며 특히 mammalian system에서는 selenocystein이 포함되어 있는 thioredoxin reductase가 사용되는데 이를 얻기 위해서는 rat liver나 human placenta같은 mammalian tissue로부터 정제를 해야한다. 하지만 그 과정이 복잡하고 실제로 active한 protein을 얻기가 힘들기 때문에 이 연구 에서는 selenium이 없는 Thioredoxin reductase를 가지고 mammalian의 2-cys Prx의 활성도를 측정하는 변형된 활성측정법을 소개하였다. 효모의 Thiredoxin reductase는 대장균에서 발현 시킨 후 DEAE와 Phenyl hydrophobic chromatography를 이용한 정제과정을 통해 flavoprotein을 포함하며 활성을 갖고 있는 상태의 단백질을 높은 수율(40 mg/L 의 배양액)로 얻을 수 있게되었으며 mammalian 2- cys Prx가 최대의 활성을 나타낼 수 있는 효모의 Thiredoxin과 Thioredoxin reductase의 적정 농도인 3 uM과 1.5 uM을 구하였다. 이 assay 방법은 세포 추출액에서 2-cys Prx활성도를 측정 할 수 있으며 2-cys Prx를 대상으로 96well plate reader를 이용한 화학물질의 High-throughput screening에 응용 할 수 있다.