제대혈 단핵세포에서 TSST-1과 LPS에 의한 IL-1α와 TNF-α의 분비에 관한 연구

Abstract

신생아는 여러 가지 면역기능에서 타 연령군에 비하여 미숙하기 때문에 패혈증 등에 쉽게 이환되며, 원인균과 임상적 특징 및 치료에 대한 반응 및 예후가 좋지 않음을 관찰 할 수 있다. 신생아 세균 감염의 원인균으로는 coagulase negative & positive Staphylococcus, group B Streptococcus, E.coli등이 가장 흔하다. 본 연구에서는 그람양성 및 음성 세균에 의한 감염에서, toxic shock 과 septic shock 의 병태생리에 중요한 원인이 되는 Staphylococcus aureus 의 외독소인 toxic shock syndrom toxin（이하 TSST-1로 칭함）과 E.coli의 내독소인 lipopolysaccharide（이하 LPS로 칭함）등에 의해 시험관내에서 신생아와 성인의 말초혈 단핵세로가 나타내는 면역반등에 어떠한 차이가 있는지 규명하기 위하여 제대혈과 성인의 말초혈 단핵세포를 TSST-1과 LPS로 자극하여, 이들 세포에서 분비되는 proinflammatory cytokine인 interleukin（이하IL-1α로 칭함）과 tumor necrosis factor-α（이하TNF-α 로 칭함）를 측정하여 비교하였다. 연구 재료로는 제대혈과 성인의 말초혈을 Ficoll-Hypaque용액을 이용하여 말초혈 단핵세포를 분리하여 사용하였으며, 세포 구성을 알아보기 위하여 FACStar^plus를 이용하여 세포의 면역표현형을 분석하였다. 연구 방법은 말초혈 단핵세포의 cytokine 분비 실험은 준비된 말초혈액 단핵세포 5×10^5（500㎕）에 각각 농도를 달리한 TSST-1（0.2㎍/㎖, 2.0㎍/㎖）, LPS（0.2㎍/㎖, 2.0㎍/㎖, 20㎍/㎖）와 gamma-interferon（이하γ-INF으로 칭함）（20-/㎖, 200-/㎖, 2000-/㎖）으로 자극 후 24, 48, 72, 96 시간 동안 배양하여 분비되는 IL-1α와 TNF-α의 양을 자극제의 농도별, 시간별로 측정하였다. 제대혈과 성인 말초혈 단행세포의 cytokine분비 억제 실험은 TSST-1（2㎍/㎖）과 LPS（0.2㎍/㎖）로 자극 시킴과 동시에 dexamethasone（0.1㎍/㎖, 1.0㎍/㎖, 10㎍/㎖）, pentoxifylline（1㎍/㎖, 10㎍/㎖, 100㎍/㎖）, 혹은 actinomycin-D（0.1㎍/㎖, 1㎍/㎖, 10㎍/㎖）등을 첨가하여 72시간 배양한 말초혈 단핵세포에서 분비되는 각 cytokine의 농도를 측정하여, cytokine분비 억제제를 넣지 않은 경우와 비교하였다. 1. 제대혈 단핵세포의 CD14(+)와 CD45(+)인 세포는 성인에 비해 낮았으며（p<0.05）, 반면 CD14(-)와 CD45(-)인 세포는 성인에 비해 높았다（p<0.05） 2. 제대혈 단핵세포의 IL-1α분비는 TSST-1, LPS와 γ-INF으로 자극 모두 시간에 따라 증가하였고（p<0.05）, LPS의 경우만 농도에 따른 IL-1α 분비의 증가를 보였다（p<0.01）. 3. 성인의 말초혈 단핵세포의 IL-1α의 분비는 전반적으로 제대혈의 경우보다 월등히 증가되었고, 농도를 달리한 TSST-1, LPS와 γ-INF등으로 자극시 모두 시간에 따라 증가하였다（p<0.05）. 농도에 따른 IL-1α의 분비는 LPS로 자극시에만 증가를 보였다（p<0.01）. 4. 제대혈 단핵세포의 TNF-α의 분비는 TSST-1으로 자극시 시간과 농도에 따라 증가를 보이거나 통계적 의의는 없었으며, LPS와 γ-INF으로 자극시에는 24시간에 최대로 분비되고 그 후 시간에 따라 감소를 보였다（p<0.05）. 농도에 따른 변화는 γ-INF으로 자극시에만 증가하였다（p<0.05）. 5. 성인의 말초혈 단핵세로의 TNF-α의 분비는 TSST-1의 자극시에는 제대혈과 비슷한 반응 양상을 보였으나, LPS로 자극시 시간에 따른 감소를 보이나 장시간 높은 농도의 TNF-α의 분비를 보여 통계적 의의가 없었다. γ-INF으로 자극시 시간에 따른 감소가 없었다. 또한 농도에 따른 TNF-α의 분비는 LPS와 γ-INF으로 자극시 농도에 따른 증가를 보였다（p<0.05）. 6. 제대혈과 성인의 말초혈 단핵세포를 TSST-1로 자극시 IL-1α의 분비는 두 군간에 자극제의 용량과 시간에 따른 차이가 없었으며, TNF-α의 분비는 각 TSST-1 농도에서 96시간에서만 성인에서 높았다（p<0.05）. LPS로 자극시 IL-1α의 분비는 LPS농도가 높을수록, 시간이 길수록 제대혈보다 성인 말초혈 단핵세포에서 높았으며（p<0.05）, TNF-α의 분비는 LPS의 각각의 농도와 배양시간 모두에서 제대혈에 비해 성인 말초혈 단핵세포에서 의미있게 높았다（p<0.01）. 반면 γ-INF으로 자극시 성인과 제대혈 단핵세포의 IL-1α와 TNF-α의 분비는 차이가 없었다. 7. TSST-1（2㎍/㎖）과 LPS（0.2㎍/㎖）로 72시간동안 제대혈과 성인 말초혈 단핵세포를 자극함과 동시에, 각각 농도를 달리한 dexamethasone, pentoxyfylline과 actinomycin-D등으로 억제시 IL-1α의 분비는 dexamethasone, actinomycin-D에 의해 크게 억제되었으며, pentoxifylline은 억제효과가 매우 적었다. 성인과 제대혈 말초혈 단핵세포의 각종 억제제에 의한 IL-1α, TNF-α 분비의 제해효과는 차이가 없었다. 결론적으로 제대혈 단핵세포를 외독소인 TSST-1과 내독소인 LPS로 자극시 IL-1α와 TNF-α의 분비는 주로 시간이 경과할수록 분비가 증가하나 성인보다는 미약하였으며 γ-INF으로 자극시는 성인과 제대혈간의 cytokine분비에 차이가 없는데 비해, LPS로 자극시 cytokine분지가 성인과 비교하여 제대혈에서 현격히 낮았다. 따라서 제대혈의 단핵세포는 IL-1α, TNF-α등의 면역조절물질의 생성능을 어느정도 보유하지만, 성인과 비교해서 매우 낮고, 이와같은 현상은 신생아에서 감염이 잘되는 요인중에 하나인 것으로 생각 할 수 있다. ; Immature immunological defence mechanism in the neonate may contribute to the high susceptibitlity to overwhelming sepsis. S. aureus TSST-1 and E. coli LPS known as one of the important pathogens of septic shock or toxic shock induce massive release of various cytokines, such as tumor necrosis factor-alpha（TNF-α）and interleukin-1α （IL-1α） produced from peripheral blood mononuclear cells（PBMC）. In contrast, limited information has been provided so far concerning the capacity of cytokine production from neonatal immune cells. This study was conducted to compare the secretion of proinflammatory cytokines, such as IL-1α and TNF-α from cord blood PBMC to those from adult blood PBMC stimulated by S. aureus TSST-1 and E. coli LPS. Also the inhibitory effects of dexamethasone, pentoxyfyline, and actinomycin-D on cytokine production from cord and adult blood monouclear cells were studied. The results were as follows. 1. The number of CD14(+), CD45(+) cells in cord blood PBMC was lower than those in adult PBMC, but CD14(+), CD45(-) cell in cord blood PBMC was higher than those in adult PBMC. 2. IL-1αwas secreted in a time-dependent manner from cord & adult blood PBMC stimulated with several cytokine inducers, and LPS stimulated adult & cord blood PBMC secreted IL-1α in a dose dependent manner. 3. TNF-α secretion from cord blood PBMC stimulated with LPS and γ-IFN significantly decreased in a time dependent manner, but not from adult PBMC. And secretion of TNF-α from cord blood PBMC reached the highest level 24 hours after stimulated with LPS or γ-IFN. The secrtion of TNF-α from adult blood PBMC showed similar pattern to those from cord blood PBMC, but higher than cord blood PBMC. 4. IL-1α & TNF-α secretion from cord & adult blood PBMC stimulated with TSST-1 had no significant difference except in TNF-α secretion by TSST-1α at 96 hours. 5. The secretion of IL-1α from adult PBMC stimulated with LPS showed higher and longer than that from cord blood PBMC. 6. IL-1α & TNF-α secretion from cord & adult blood PBMC stimulated with γ-IFN had no significant difference. 7. Dexamethasone and actinomycin-D showed a significant inhibitory effects on secretion of IL-1α and TNF-α from adult and cord blood PBMC stimulated by TSST-1 and LPS, but pentoxifylline showed lesser inhibitory effects than dexamethasone and actinomycin-D. However there was no difference of inhibitory effects of dexamethasone, actinomycin-D and pentoxifylline on cytokine secretion between adult and cord blood PBMC. In summary, proinflammatory cytokines such as IL-1α, TNF-α in cord blood PBMC were secreted in a time dependent manner, but the amounts of IL-1α and TNF-α secretion were lesser than those of adult blood PBMC, especially stimulated by LPS. These results suggest that increased susceptibility to infection in neonatal period may be partially from a functional immaturity of cord blood mononuclear cells.