Function of AHNAK in TGF-β signaling

Abstract

AHANK is an exceptionally large protein (700kDa) and contains 36 central repeated units (CRUs) of highly conserved 128 residues. Each repeated unit shares more than 80% identity. Because of this unique structure, AHNAK has been proposed to be a scaffolding protein in cellular signaling. However, the biochemical properties of AHNAK have not yet been defined. We recently reported that 4CRUs of AHNAK bind to PLC-γ and PKC-α isozyme and activate them in plasma membrane. The 4CRUs localize into the nucleus in response to TGF-β. To understand the function of 4CRUs, we performed a yeast two-hybrid screening and identified Smad as a binding protein. 4CRUs interacts with Smad2/3 and Smad4 in a TGF-β dependent manner in NIH3T3 cells, cell cycle is arrested at G0/G1 phase, and c-Myc is downregulated in NIH3T3 cells stably expressing 4CRUs. Furthermore, we have found that 4CRUs activates the transcriptional activity of Smad binding element (SBE) and represses the transcriptional activity of c-myc promoter in response to TGF-β. These results suggest that AHNAK acts as a scaffolding protein between c-myc and Smad proteins in TGF-β signaling.;neuroblastoma 세포와 피부 상피세포에서 처음으로 클로닝된 AHNAK은, 700kDa에 달하는 비정상적인 크기로 인해 유대어로 “거인(Giant)”을 뜻하는 ‘AHNAK’으로 명명되었다. AHNAK 단백질은, 250 개의 아미노산으로 이루어진 NH2-termius, 1,0002 개의 아미노산으로 이루어진 COOH-말단 사이에 4,392 개의 아미노산으로 이루어진 중앙반복구조로 이루어져 있고 전체적인 구조는 아령모양이지만 중앙반복구조의 경우 구형으로 되어있다. 중앙반복구조는 128개의 아미노산이 36회 반복되는데 각각의 중앙반복구조는 80%의 동일성을 가진다. 이 특이한 구조로 인해 AHNAK은 여러 가지 외부신호에 반응하여 작동되는 세포내 신호전달체계에 있어서 scaffolding protein으로서의 역할을 할 것이라고 여겨지고 있다. AHANK은 칼슘이온의 항상성 유지에 기여하고 cytoskeleton의 토대를 이룬다는 보고가 있으며 최근에는 암과 혈관생성과 관련하여 중요한 역할을 한다는 보고도 있다. 그러나 아직까지도 AHNAK의 생화학적 역할에 대해서는 거의 알려진 바가 없다. 그러나 AHNAK의 중앙반복구조는, scaffolding protein으로 작용하는 것뿐만 아니라 거대함에서 오는 진화적 불이익을 막기 위해서라도 다양한 기능을 담당하고 있으리라 생각된다. AHNAK의 생화학적 기능을 알아보기 위해 우리는 먼저 Yeast two hybrid system을 이용하여 AHNAK과 결합하는 여러 가지 단백질들을 알아내었고 그 중에 하나가 바로 “Smad1”이라는 단백질이다. 이 단백질은 TGF-β superfamily signaling에 관여하는 중요한 단백질이며 모든 Smad 단백질은, Smad 단백질간에 그다지 차이가 없는 MH1 domain (NH2-말단)과 MH2 domain (COOH?말단) 사이에 비교적 가변성이 있는 Linker 부분으로 이루어져 있다. AHNAK의 경우, Smad1뿐만 아니라 -2, -3, -4와도 결합하는데 이 같은 결과는 AHNAK이 MH2 domain과 강하게 결합한다는 yeast two hybrid의 결과와 함께 보았을 때 매우 합당한 결과라 하겠다. 다음으로 AHNAK과 endogenous Smad 단백질들과의 결합은 어떻게 달라지는지 알아보기 위해 immunoprecipitation을 수행하였는데 흥미롭게도 AHNAK은 TGF-β 자극이 없는 상태에서도 Smad2/3 및 Smad4와 결합하고 있다가 TGF-β 자극이 오게 되면 Smad2와의 결합은 더욱 강해지는 반면 Smad-4와의 결합은 끊어지고 Smad2/3-Smad4 complex는 깨지는 것을 알 수 있다. 한편, TGF-β signaling에 의한 세포내 현상들 중에서도 가장 두드러지게 나타나는 것이 바로 c-myc의 발현 및 protein level이 현저히 감소한다는 것이다. 이는 AHNAK-stably expressing NIH3T3에서 원래의 NIH3T3에 비해 c-myc의 발현 및 protein level이 매우 낮아진 결과와 함께 놓고 봤을 때 TGF-β 자극에 의한 c-myc의 발현 억제에 AHNAK이 연관될 수도 있다는 가능성을 제시해준다. 그러나 TGF-β 자극에 의한 c-myc의 발현 억제 및 protein level을 낮춤에 있어 기존에 알려진 TGF-β inhibitory element (TIE)가 관여하는 것은 아니다. 왜냐하면 우리가 사용한 c-myc promoter는 TIE sequence가 포함되어 있지 않음에도 불구하고 AHNAK에 의해 그것의 발현 정도가 낮아졌기 때문이다. 이 같은 결과들을 종합하여 우리는 AHNAK이 TGF-β에 의한 c-myc의 발현 억제 및 protein level을 낮춤에 관여한다고 제안하는 바이다.