IgE-dependent histamine-releasing factor-binding peptides show anti-allergic activity in vivo

Abstract

Allergies are known to be caused by inheritable hypersensitive formation of IgE in response to allergens, or disruption of balance between increasing IgE secretion and decreasing IgE secretion. Upon exposure to allergens, an immediate reaction occurs and various cells associated with inflammation are gathered. After several hours, late-phase reaction (LPR) occurs by histamine and other cytokines secreted from basophils, eosinophils and lymphocytes. In LPR, histamine is secreted from basophils, and both inflammatory and immune cells are recruited to the inflamed site after the acute-phase signs are diminished. LPR is also developed in only about half of the patients suffering from allergies. Therefore, the causes of histamine secretion from basophils and of its development into LPR have been issues of great interest. IgE-dependent histamine-releasing factor (HRF) was reported to play a predominant role in the development into LPR. HRF has been identified in the intracellular region of the cell and also as a cytoplasmic Na,K-ATPase repressor. HRF is also found extracellularly in the culture supernatant of macrophage and platelets, in the fluid of nasal lavages, and in skin blisters of patients with LPR but not in the early phase in the fluid of nasal lavages and skin blisters of allergic patients. HRF is designated as IgE-dependent HRF since it harbors histamine-releasing activity. Human recombinant HRF (HrHRF) directly stimulates histamine release and IL-4 and IL-13 secretion from basophils, and enhances histamine release and the secretion of IL-4 and IL-13 from IgE-bearing basophils activated by anti-IgE Ab. In addition, HrHRF causes chemotaxis for eosinophils and increases IL-8 secretion from eosinophils. However, the histamine-releasing effect of HRF is controversial because the activity of rHRF has been reported to be much less effective than that of HRF produced from activated mononuclear cells (HRFmn), suggesting that active HRF might be different from rHRF. Here, I showed that modified rat rHRF (RrHRF), MHRF-A and MHRF-B, caused a large increase in its IL-8 secretion ability in BEAS-2B cells and histamine releasability in human basophils. It is uncertain whether HRF in the blood or fluid of nasal lavage of patients with LPR is MHRF-A or MHRF-B, but I nevertheless consider that protease modification is an important clue to differentiate active HRF from inactive HRF in the stimulation of inflammatory cells. I also showed that three novel peptides, HBP1, HBP2 and HBP4, selectively bind to MHRF-B, but not to full-length HRF, using a phage-displayed 7-mer peptide library screening. HBP2 dramatically inhibited the release of IL-8 by MHRF-B from BEAS-2B cells and decreased the lethal rate and concentration of histamine of serum in an anaphylaxis animal model. HBP2 also reduced symptoms of allergic rhinitis including nasal rubs and eosinophil infiltration in nasal mucosa. In this work, I characterized the active form of RrHRF having histamine-releasing activity and identified HRF-binding peptides that can inhibit the cytokine-like effects of RrHRF. These results suggest that the functional inhibition of HRF is a new strategy for the development of anti-allergic drugs, and that HBP2 is a potential drug for the specific treatment of various allergic disorders caused by HRF.;알러지는 유전적으로 알러젠 (allergen)에 대해 과민하게 IgE를 생성하거나, IgE의 분비를 증가시키는 사이토카인과 IgE의 분비를 감소시키는 사이토카인간의 균형이 파괴된 것으로부터 기인한다고 알려져 있다. 일단 알러젠에 노출되면, 즉시 반응 (immediate reaction)이 일어나고, 염증에 관련된 여러 세포들이 모이게 되며, 수 시간 후에는 호염기구, 호산구와 림프구로부터 분비되는 히스타민과 사이토카인에 의해 후기 반응(late-phase reaction)이 일어나게 된다. 후기 반응에서는 호염기구로부터 히스타민이 분비되고, 염증 세포와 면역 세포들이 염증 부위로 모이게 된다. 이 때에는 처음에 반응을 시작하게 했던 알러젠이 없으므로, 무엇이 호염기구에서 히스타민을 분비하게 하는 것과, 알러지 환자의 약 절반만이 후기 반응으로 진전되는데, 그 원인 물질이 무엇인가 하는 것이 큰 관심 대상이었다. IgE-의존적 HRF는 만성 알러지 질환 발생에 있어 주요한 작용을 한다고 알려져 있다. HRF는 친수성이고 세포질내에 존재하는 단백질로 Na,K-ATPase의 활성 저해제로도 알려져 있다. HRF는 세포 밖에서도 발견되는데, 대식세포와 혈소판 배양액, 후기 반응 알러지 환자의 비세척액이나 수포에서 검출되고 히스타민 분비능에 있기 때문에 histamine-releasing factor (HRF)라 명명되었다. 인간 재조합 HRF (HrHRF)는 직접적으로 호염기구로부터 히스타민, IL-4, IL-13의 분비를 촉진하고, IgE-감작된 (sensitized) 호염기구를 자극하여 이들의 분비 정도를 증가시키는 것으로 알려졌다. HRF는 또한 호산구의 화학 주성(chemotaxis)을 유발하고 호산구로부터의 IL-8분비를 증가시킨다. 최근 부데 (Budde) 등 (2002)은 단핵구 배양 상등액에서 분리한 HRF (HRFmn)와 재조합 HRF (rHRF)는 호염기구에서 히스타민을 분비하게 하는 능력면에서 동일하지 않음을 보고하면서, HRFmn과 rHRF는 동일한 factor가 아닐 가능성을 제시하였다. 또한 HrHRF 특이적인 효소 결합 면역 흡착 검사 (ELISA)에 의해 HRFmn에서 HRF가 검출되지 않음을 언급하였는데 이는 HRFmn과 rHRF와의 구조적 차이점을 시사한다고 할 수 있다. 이에 본 논문에서는 rHRF의 경우 전체 단백질 (whole protein)로 존재할 때와 변형된 상태 (modified HRF, MHRF)로 존재할 때 염증 세포에 대한 작용이 다름을 밝혀내었다. 즉, MHRF는 RrHRF에 비해 BEAS-2B cells에서 증가된 IL-8의 분비능을 보였고, 감작된 호염기구에서의 히스타민 분비능도 향상되었다. 현 시점에서 후기 반응 환자의 혈장이나 비세척액 등에 변형된 상태의 HRF가 존재하는지는 명확하지 않다. 그러나 HRF의 이런 변형은 활성형 HRF와 비활성형 HRF를 구분하는데 있어 중요한 단서를 제시해 준다고 사료된다. 본 연구에서는 또한 헵타머 파아지 디스플레이라이브러리 (7-mer phage-display peptide library)를 검색하여 변형된 HRF (MHRF-B)에 결합하는 세 종류의 펩타이드 (HBP1, HBP2, HBP4)를 밝혔다. 특히 HBP2는 BEAS-2B cell에서 MHRF-B에 의해 유도된 IL-8 분비를 효과적으로 억제하였고, 감작된 호염기구에서 MHRF-B에 의해 증가된 히스타민 분비를 농도 의존적으로 감소시켰다. 이런 HBP2의 작용은 알러지 반응을 유도한 동물 모델에서도 검증되었다. 과민반응 (anaphylaxis)이 일어나도록 한 동물 실험에서 HBP2의 전처리는 농도 의존적으로 래트의 치사율을 감소시켰고 혈장 내의 히스타민 농도 또한 유의하게 감소시켰다. 반복적으로 OVA에 노출시킨 비염 모델에서 HBP2의 반복 투여는 비염의 증상을 완화시켰고 비점막으로의 호산구 이동을 감소시켰다. 본 논문은 활성형 HRF을 밝히고 그런 HRF의 사이토카인 유사능을 억제 할 수 있는 HRF-결합 펩타이드를 규명한 것으로 이상의 결과들은 HRF의 작용을 조절하는 것이 항알러지 약물의 개발에 있어 새로운 접근이 될 수 있음을 제시해 준다. 또한 HBP2는 HRF에 의해 발생된 여러 알러지 반응을 선택적으로 제어할 수 있는 약물로의 개발 가능성이 있을 것으로 사료된다.