Identification of Transcription Factor Sox10 Target Genes in Melanoma

Abstract

Sox family 는 DNA binding domain인 high mobility group (HMG) box를 가진 전사인자그룹이다. 이들은 포유동물에서 20종류의 전사인자를 가지고 있으며, 배 발생과정 중 여러 단계에서 발현되는 것이 확인되었다. 이 중 Sox10은 신경 능선세포에서 유래된 색소세포 (melanocyte) 발달에 중요한 역할을 하고 있다. Sox10에 돌연변이가 생기게 되면, 동형 접합체일 경우 (-/-) 색소세포의 파괴가 일어나며 장내 신경계에 이상이 생기고 배 발생 과정 중 치사한다. 또한, 이형 접합체 (+/-) 일 경우에도 부분적인 색소세포의 이상과 함께 거대 결장증 (Dominant megacolon) 이 나타나게 된다. 이렇게 선행 연구에서 보듯이, Sox10의 기능이 상실되었을 경우, 신경 능선 줄기 세포에서 만들어지는 색소세포를 포함한 대부분의 세포는 증식 미비 혹은 세포 사멸로 인해 정상적으로 발생하지 못한다는 것을 알 수 있었다. 이 같은 현상은 전사인자인 Sox10이 세포 내에서 여러 유전자들을 조절함으로써 일어나는 결과로 보여진다. 따라서, 본 연구에서는 melanoma cells (흑색종 세포) 에서 Sox10의 기능을 좀 더 알아보기 위해서 그들에 의해 직, 간접적으로 조절되는 유전자를 동정해 보기로 하였다. Sox10에 의해 조절되는 유전자들을 찾기 위해서 먼저, 세포 내에 Sox10의 유무에 따라 다른 유전자들의 발현에 어떠한 변화가 있는지 살펴보았다. RNAi 방법을 사용하여 세포 내에 Sox10의 발현을 감소시킨 후, 이 세포 내의 total RNA를 얻어 genechip array를 수행하였다. Genechip array 결과, 약 1,400여개 이상의 gene이 대조군 세포 내에 있는 gene과 비교하였을 때 발현양상의 변화를 보였다. 그 중 약 660여개의 gene들이 Sox10 발현이 감소함에 따라 동시에 gene 발현이 감소하였고 2배 이상 발현이 감소된 gene들이 이 중 58개로 확인되었다. 이들은 그들의 프로모터 부위가 Sox10에 의해 조절되므로 Sox10의 발현 감소에 따라 동시에 그들의 발현도 변화된 것으로 볼 수 있다. 따라서, 이들 gene의 전사 시작 사이트에서 10kb upstream부위를 대상으로 각 종마다 (Mouse/Rat/Human/Dog/Chicken) 유전자 서열 유사성을 분석하였다. 종간에 보존되는 부위에서 이미 알려져 있는 Sox binding site를 찾고 동시에 가까운 위치에서 Sox와 함께 결합체를 이루어 발현 조절에 시너지 효과를 일으키는 것으로 알려져 있는 POU binding site를 조사하였다. 그 결과, 58 개의 genes 에서 2,857 개의 Sox 와 POU binding sites 를 얻었다. 이 중, Sox 와 POU binding sites를 동시에 가지고 있는 genes 40개를 대상으로 염색체 면역 침전 (chromatin immuno precipitation) 실험을 실행하고 있다. 현재까지 17개 gene을 상대로 실험한 결과, 17개 gene 중 8개 gene에서 앞서 찾아낸 potential binding site에 Sox10이 binding한다는 것을 알 수 있었다. 본 연구는 Sox10 전사인자에 의해 조절되는 여러 유전자들을 동정하는데 효과적인 방법을 제시하였다. 앞으로 RNAi, genechip array 그리고 염색체 면역 침전 (ChIP) 실험 방법을 통하여 얻어진 Sox10 target gene들을 reporter assay 와 sequence analysis 등을 통하여 Sox10이 직접적으로 조절하는 target genes을 알아보아야 한다. 또한, 조절되는 유전자들의 특징과 조절 부위의 기능에 대해서도 연구해 볼 필요가 있다.; Sox10 is a member of the SRY (sex-determining factor)-like, high-mobility-group (HMG) DNA binding protein. Sox10 plays a critical role in the development of neural crest-derived melanocytes. Several mutations in human and mouse Sox10 genes have been shown to result in reduction of pigment-producing cells, varying levels of hearing impairment, aganglionic megacolon, and dysmyelination. In melanocytes, Sox10 has been shown to regulate the expression of microphthalmia-associated transcription factor (MITF) and dopachrome tautomerase (Dct/Trp2) genes. Here I have developed a protocol for identifying genes that are directly regulated by a specific transcription factors and demonstrate its efficacy using Sox10 as a model case. I infected B16 melanoma cells were with RNAi lentiviruses that express shRNAs against Sox10. Infection of B16 cells with the virus reduced Sox10 expression. Sox10 target genes were identified by genechip array analysis with RNA from infected cells. This was followed by in which evolutionarily conserved enhancer regions were examined for the presence of Sox protein binding sites. The targets were validated by chromatin immunoprecipitation assay which confirms that a given gene is directly targeted by Sox10. These results suggest that genechip array screening, in combination with comparative genomic analyses and chromatin immunoprecipitation will be useful for the identification of directly regulated target genes for many mammalian transcription factors.