Functional Roles of human Fas Associated Factor 1 (hFAF1) in Ubiquitin - Proteasome Degradation Pathway

Abstract

Human Fas Associated Factor 1 (hFAF1) was known as a Fas binding protein which potentiates Fas-induced apoptosis. However, the cellular functions of hFAF1 were not clearly understood. In recent studies, hFAF1 was identified having several ubiquitin related domains; ubiquitin homologous domains (UBs), domain homologous with proteins involved in the ubiquitin pathway (UBX) domain, and ubiquitin associated (UBA) domain, in addition to Fas-interacting domain and death effect domain- interacting domain. This suggests that hFAF1 plays a key role in ubiquitin?proteasome degradation pathway by recruiting ubiquitinated proteins through UBA domain, and VCP through UBX domain (1, 2). In this study, we made an effort to find out the ubiquitinated substrates binding to UBA domains of hFAF1 in vivo and in vitro based on the recent report that proteins involved in ubiquitin-proteasome system recognize each specific substrate. In vitro pull down assay using GST-hFAF1-UBA[1-81] was adopted to examine whether hFAF1 has specific ubiquitinated substrates. Proteins binding to UBA domain of hFAF1 were processed using ESI-q-TOF tandem mass spectrometry coupled to nano-liquid chromatography. Nine proteins were identified as ubiquitinated proteins and the exact ubiquitinated sites of them were determined by selective sequencing of the peptide having ubiquitinnated signal peptide (114.1 Da). Another part of this study is to examine the relationship between the hFAF1-interacting proteins. hFAF1, as a scaffolding protein, was known to interact with multi-ubiquitinated proteins, HSP70, NF-kB p65, and VCP which were involved in ubiquitin-proteasome system. However, it is not known how each protein affects the binding of the other proteins and how to regulate the hFAF1 functions. These studies on binding partners of hFAF1 will provide detail information for understanding the function of hFAF1 in ubiquitin-proteasome pathway. Finally, intracellular functions of hFAF1 in the apoptotic signaling pathway are under investigation to link the accumulation of ubiquitinated proteins to the apoptotic signaling.; Human Fas Associated Factor 1 (hFAF1)은 Fas에 결합하는 단백질로 밝혀졌다. hFAF1은 세포 내에서 Fas가 유발하는 세포사멸을 강화시킨다고 알려졌으나 어떠한 역할을 하는지 아직 명확히 밝혀진 바 없다. 최근 연구에서 hFAF1은 Fas-interacting domain (FID)과 death effect domain-interacting domain (DED-ID) 이외에도 ubiquitin homology domain (UBs)와 domain homologous with proteins involved in the ubiquitin pathway (UBX)와 ubiquitin associated (UBA) domain 등의 ubiquitin과 관련된 domain들을 가지고 있음이 확인되었다. 이를 토대로 hFAF1이 UBA domain에 ubiquitinated proteins을 이끌고 UBX domain을 통해 Valosin containing protein (VCP)과 결합함으로써 ubiquitin-proteasome degradation pathway에 중요한 역할을 할 것임을 추측할 수 있다. 이 연구에서는 ubiquitin-proteasome system을 매개하는 단백질들이 각자 특정한 단백질을 인식한다는 최근 보고에 의거하여 hFAF1의 UBA domain에 결합하는 ubiquitination 된 단백질을 찾고자 하였다. hFAF1이 특정한 ubiquitination 된 단백질과 결합하는가를 확인하기 위해 UBA domain을 포함하는 GST-tagged hFAF1[1-81]을 이용하여 in vitro pull down assay를 수행하였으며 hFAF1의 UBA domain에 결합한 단백질들은 nano-liquid chromatography가 부착된 ESI-q-TOF tandem MS를 이용하여 확인되었다. 그 결과 9개의 ubiquitination 된 단백질들이 확인되었으며, 각 단백질에서 ubiquitination의 signal sequence (114.1 Da)을 가진 펩타이드의 아미노산 서열을 결정함으로써 정확한 ubiquitination 된 Lys residue을 밝혀내었다. 한편으로는 hFAF1에 결합하는 단백질들간의 관계에 대하여 연구하였다. hFAF1은 scaffolding protein으로서 multi-ubiquitinated proteins와 HSP70와 NF-kB p65와 VCP등의 ubiquitin-proteasome system와 관련된 단백질들과 결합한다는 사실이 밝혀져 있다. 그러나 각 단백질과 hFAF1의 결합이 다른 단백질과 hFAF1간의 결합에 어떠한 영향을 끼치는지, 또 이러한 결합이 hFAF1의 기능에 어떠한 영향을 끼치는가에 대해서는 알려진 바가 없다. 이러한 연구는 ubiquitin-proteasome system에서 hFAF1의 기능을 이해하는 데 도움이 될 것이다. 마지막으로 hFAF1가 ubiquitination 된 단백질을 축적시키는 기능과 세포사멸을 강화시키는 기능 사이에 어떠한 연계가 있을 것인가를 알아보기 위해 세포사멸 신호전달 체계를 연구하고 있다.