Design and Characterization of the Antibodies Detecting Reversible Oxidation of Protein Tyrosine Phosphatases

Abstract

Transient increase of reactive oxygen species (ROS), produced by the stimulation of growth factors, amplify various protein tyrosine phosphorylation that is required for signaling through the reversible oxidation of active site cysteine of protein tyrosine phosphatase (PTPs). The cysteine residue in the active site of protein tyrosine phosphatase 1B (a kinds protein of PTPs which play as counterpart of insulin receptor kinase) is readily oxidized because they have lower pK_(a) values (5.4 in mammalian system) than those of other cysteines. Biotin-conjugated iodoacetamide (BIAM) has been used to screen the oxidation-sensitive cysteines, but the method suffers from its inherent non-specificity and had limitation in the application using immunoblot analysis. To overcome the limitation of biotin-conjugated iodoacetamide method and detect inactivated PTPs directly and specifically, we designed and characterized an antibodies to PTP-SO₃ (sulfonylated PTP) and PTP-IAA (iodoacetic acid labeled PTP). Sulfonylated PTP antibody and iodoacetic acid labeled PTP antibody detected the oxidized PTP-especially PTP1B by antibody of PTP-SO₃ - in specific and sensitive manner. Treatment of H₂O₂ to recombinant PTP1B and HeLa cell lysate were analyzed by immunoblotting using antibody PTP-SO₃. To improve antibody detection, active cysteine was labeled by IAA (iodoacetic acid) and performed in situ oxidation after PVDF membrane transferred. The reversible oxidation of PTPs were monitored by antibody of PTP-SO₃ and PTP-IAA when applied to EGF stimulated A431 cells. Quinone compounds have been researched as potent oxidant with toxicity. It was reported that PTP1B was inactivated by 9,10-phenanthrene-quinone (9,10-PQ) as oxidation of active site cysteine sulfonylated form. Inactivated Recombinant PTP1B was detected by antibody of PTP-SO₃ after incubation with 9,10-PQ. Treatment of 9,10-PQ to HeLa cells was screened by GAPDH-SO₃ and 2-Cys Prx-SO₃. antibodies. There was the detection of sulfonylated forms of GAPDH and 2-Cys Prx. However, the generation of sulfonylated forms of PTP1B was not detected by 9,10-PQ stimulation. Thus, PTP1B may be regulated as more critically at redox cycle concerning with quinone compound.;세포 내에서 발생하는 활성 산소종(reactive oxygen species : ROS)은 일반적으로 유해하다고 알려져 왔다.그러나 최근에는, 여러 세포들이 펩타이드성 성장 인자(peptide growth factor)들과, 호르몬등에 의해 일시적으로 ROS를 생성 한다는 사실이 밝혀지면서 세포 신호전달에 관여하는 이차 신호 전달자(second messenger)로서의 의미가 대두되고 있다. 세포에 어떠한 자극이 주어지면Protein tyrosine phosphatase (단백질 탈 인산화 효소) 와 Protein tyrosine kinase(단백질 인산화 효소)들간의 활성 조절에 의해 신호가 전달되어진다. 또한 이와 함께 생성된 ROS는 Protein tyrosine phosphatase 들을 산화시켜 일시적으로 불활성화 시킨다.따라서 protein tyrosine kinase 들이- 길항제와 같은 탈인산화효소들이 억제됨에따라-세포내 여러 단백질들을 더욱 인산화 시킴으로 신호가 증폭되며 오래 유지 될 수 있게 된다. 이러한 맥락에서 Protein tyrosine phosphatase 들의 일환이면서 세포질에 위치한 PTP1B(protein tyrosine phosphatase 1B)가 산화형으로 불활성화된 형태를 관찰할수 다면 ROS에 의한 세포신호전달의 단백질의 변화를 쉽고 정확히 screening 할 수 있게 된다.따라서 PTP1B 산화형 항체(α PTP1B-Cys-SO₃ :sulfonylated-PTP1B)를 개발하고 그 활성을 세포에 적용하여 면역학적인 분석-immunoblot assay-을 통해 분석하였다. 먼저 PTP1B의 효소로서의 활성을뛰는 시스테인 (cysteine residue)을 중심으로하는 VHCSAG peptide sequence 를 퍼포믹산(performic acid)으로 산화시켰다. 이를 High performance liquid chromatography (HPLC)를 통해 정제한 후 Mass spectroscopy 로 산화된 시스테인(VHC-SO₃-SAG)을 확인하고, 확인된 Peptide를 Rabbit에 접종하여 항체를 얻었다. 재조합PTP1B 를 pervanadate로 산화시켜 산화형 항체를 이용해 Western blotting을 해 보았을 때, 산화시키지 않은PTP1B에서는 이 항체에 의해 나타나는 band가 없는 반면 산화시킨PTP1B는 처리한 pervanadate의 농도와 그 PTP1B의 농도가 증가함에따라detection되어지는band가 증가함을 통해PTP1B 산화형 항체(α PTP1B-Cys-SO₃ :sulfonylated-PTP1B)가 특이적(oxidation specific)으로감지 함을 확인하였다. 또한 이 항체의 activity를 높이기 위해 (i)IAA labeling 과 (ii) in situ-oxidation을 시도하였다. PTP1B active site cysteine은 pKa 값이 5.4이기때문에 일반적인 생리적 pH값에서 작용기가(-)전위를 뛰는 -S- (thiolate anion) 형태로 존재한다. 따라서 (i) Iodoacetic acid (IAA)로 알킬레이션 (alkylation) 한 후, (ii) PVDF-(polyvinylidenefluoride) membrane에 transfer 하여 membrane 을 performic acid 상에서oxidation 시키면 (in-situ oxidation), 활성형태의 PTP1B cysteine은 산화되지 않고 불활성 상태의PTP1B만 완전히 산화되어서PTP1B 산화형 항체(α PTP1B-Cys-SO₃ :sulfonylated-PTP1B) 와 면역복합체(immune complex)를 더욱 잘 형성할수 있게 된다.이 방법등을 통해 HeLa 세포에 과산화수소(H₂O₂)를 처리했을 때H₂O₂농도가 증가함에 따라 Western blot 의 band intensity 가 증가하였다.또한H₂O₂를 세포에 처리하고 시간별로 관찰하였을 때 PTP1B가 불활성되었다가 가역적으로 활성이 회복되는 것을 detection -band 가 증가후 감소되어짐- 을 통해PTP1B의H₂O₂ 에 의한 활성의 변화를 monitoring 할수 있었다. 이 PTP1B산화형 항체를 EGF(epidermal growth factor)를 처리한 A431세포에 적용해 보았다.EGF는 A431세포에서H₂O₂를 생성시켜 PTP1B를 가역적으로 불활성화시킨다는 사실이 밝혀져 있다.EGF를 처리한 A431을 시간별로 얻고 이 샘플을 Western blotting 해 보았을 때 ,EGF처리 10분까지 증가하던 band가 시간이 지남에 따라 감소되는 것을 통해 쉽게 screening 할 수가 있었다.또한 산화형 항체와 같은 방법으로 제작한 시스테인에 IAA를 붙인 항체를 통해서도 EGF에 의해 산화되어 가역적으로 불활성화된 PTP1B를 detection할수 있었다. 세포 내에서 자연적으로 생성되어지면서 동시에 환경오염 물질중의 하나로 석탄 연료의 불완전연소로 인해 생성되는 퀴논 화합물(Quinone compound)은 PTP1B를 직접적으로Cys-SO₃ (:sulfonylated-PTP1B) 로 산화 시킬수 있다.재조합PTP1B에 9,10-phenanthrenequinon(9,10-PQ)을 처리한 in vitro실험에서는 처리한 9,10-PQ의 농도에 따라Cys-SO₃ 로 산화된PTP1B가 증가하였다. 그러나 HeLa cell에 직접 9,10-PQ를 처리한 in vivo 실험에서는 글리세르-3-탈인산화 효소(glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase:GAPDH) 와 퍼옥시리독신 (peroxiredoxin:Prx) 의 산화형은 발견하였으나,이 PTP1B 산화형 항체를 통한 Western blotting에서는 처리하지 않은 세포와 비교했을때 별다른 차이를 나타내지 않았다.단지PTP1B가 아닌 다른 위치에서 뚜렷히 변하는 band를 발견하였다. 본 연구를 통해 기존의 밝혀진 PTP1B의 가역적 산화를α PTP1B-Cys-SO₃ (:sulfonylated-PTP1B)를 통해 선택적이면서(specific) ,기존의 방법들보다 간편하게 탐지할 수 있음을 밝혔다. 또한 Quinone에 의한 PTP1B의 변화는 관찰하지 못하였지만, GAPDH와Prx의 연구결과와 함께dramatic하게 발견되는 signal을 identify 하여 quinone 에의한 PTP1B의 영향을 더 연구한다면, 당뇨병등에서 인슐린 신호전달을 담당하는PTP1B inhibitor 로서 임상적으로 치료제 개발에 도움이 될 수 있을 것으로 보인다.