Towards identification of HRT2 Interacting proteins

Abstract

Notch-Delta signaling pathway는 진화를 통하여 대부분의 metazoan 종에서 보존되어 있는 중요한 신호 전달 체계이다. Notch-Delta signaling pathway는 발생 과정 중 세포의 fate determination과 growth에 관여하며 pattern formation과 organ structure에 영향을 미치게 된다. Notch - Delta signaling pathway는 신경계 이외의 많은 조직 형성과 장기 발생에서 상응하는 역할을 가질 것으로 추측되고 있다. 이에는 심혈 관계, 가슴샘, 신장, 이자 등이 포함된다. Notch-Delta signaling은 궁극적으로 세포 핵 내로 전달되어지며 그 결과 basic helix-loop-helix transcription factor family의 일종인 Hes gene과 HRT gene family가 활성화된다. 그 역할은 여러 종류의 gain-of-function과 loss-of-function 실험을 통해 확인되었다. 그 중 HRT2는 위에서 밝힌 대로 Delta-Notch signaling에 의해 조절 받는 전사 조절 인자다. 특이할 점은 발생 과정 중 심장 기관 발달에 중요한 역할을 한다는 것이 알려져 있으며 gene targeting을 통하여 만들어진 knock-out의 경우 심장 비대 현상과 함께 심장 조직에 fibrotic scar가 생긴다는 것이다. HRT2 역시 basic-helix-loop helix protein 이므로 여러 종류의 단백질과 복합체를 구성할 것으로 추정되며 이들의 동정과 기능 조사가 심장 조직 형성과 장기 발생을 이해하는데 도움이 될 것으로 생각된다. HRT2는 target gene의 활성을 억제하는 repressor로 알려져 있는데 이 과정에서 HRT가 homodimer, 또는 다른 bHLH protein과heterodimer를 이룰 수 있는 것으로 알려져 있다. 따라서, affinity tagged HRT2를 발현하는 transgenic mouse를 제작하여 단백질을 다량으로 발현시켰고, 나아가서, 생체 조직에서 HRT2와 복합체를 이루는 단백질을 Mass spectrometry analysis를 이용하여 동정하는 실험을 계획하였다. 우선 형질 전환 쥐를 만들기 위한 transgenic construct를 제작하였다. Figure 2에서 보이는 대로 full-length HRT2의 N-terminus 부위에 9myc-TEV-6His tag를 부착하였다. Myc 부위는 일 단계 affinity 정제를 위한 것이며 TEV 부위는 protease를 이용하여 HRT2와 함께 혼합체를 이루는 단백질의 release를 위한 것이며 6개의 histidine 아미노산 residue는 이 단계 affinity 정제를 도와준다. 쥐의 모든 조직에서 고른 발현을 위해서 선택된 promoter는 ubiquitin promoter이다. Ubiquitin promoter가 기대했던 대로 다양한 세포에서 construct를 발현시킨다는 것을 밝혔고, 따라서Transgenic mouse를 제작하기 위하여 위의 construct를 pronuclear injection 방법으로 fertilized mouse egg에 도입하였다. 첫 번째 generation에서 태어난 17마리의 쥐들의 꼬리에서 DNA를 구하여 PCR 방법으로 transgenic mouse가 있는가를 조사하였고, 가능성 있어 보이는 쥐들을 교배시켜 다음 세대의 쥐에서는 germ line transmission을 Western blot analysis을 통해 확인하였다. 한 편 세포 차원의 실험으로 jurkat에서의 HRT2 expression을 확인하고, 마찬가지의 방법으로 상호작용하는 단백질을 동정해내고자 하였으나 세포에서 다량의 HRT2발현이 유지되는 단백질을 확보하는 것도 쉽지 않았으며, tagging이 되지 않은 세포와 다른 패턴을 발견 할 수 없어 아직 HRT2와 상호작용하는 단백질에 대해 단정지을 수 없다. 부가적으로, 후보가 될만한 단백질의 범위를 좁혀 단백질간의 상호작용을 보는 다른 실험 방법을 이용한다면 다른 결과가 나올 수도 있을 것이라고 생각된다. 이 실험을 통하여 Ubiquitin promoter를 이용한 HRT2 형질 전환 쥐를 확보하였으므로 생체 내에서 HRT2와 상호작용하는 단백질을 찾아낼 수 있는 기틀을 마련하였다고 할 수 있겠다.;Notch-delta signaling is involved in various cell fate determination events during development of metazoan species thus far examined. Recent evidences have demonstrated that the Notch pathway is involved in multiple aspects of vascular development, including proliferation, migration, smooth muscle differentiation, angiogenic processes, and arterial-venous differentiation. The HRT genes constitute a subfamily of basic helix-loop-helix transcription factors and have been shown to be directly up-regulated by Notch ligand binding. HRT2 in particular has been shown to be involved in the cardio vascular development. The bHLH transcription factors including HRT2 are known to function as dimers. HRT2 also expected to make additional protein-protein contacts some of which may be critical for their role as transcriptional repressors. To understand the role of HRT2 fully it is necessary to identify its dimerizing partner (it may form homodimer) and other interacting proteins. Transcription factors often form multi-protein complexes, and combinatorial actions of transcription factors in such complexes dictate specificity of downstream gene expression. Characterizing such interacting proteins of HRT2 in vascular development is important to understand the molecular nature of vascular system and cardiac disease. In this study, we made transgenic mice expressing HRT2 under the control of ubiquitin promoter. We confirmed the expression of transgenic in the cardiac tissues of the mice. This implies that we have the tools to identify HRT2 interacting proteins in vivo.