Regulation of NADPH oxidase 4 by SH3 domain containing YSC84-like 1 (SH3YL1)

Abstract

활성 산소종(Reactive oxygen species, ROS)은 유기호흡을 하는 생물에게 있어 필수적인 산소가 세포 내의 효소 그리고 대부분의 전자 운반 과정 혹 은 에너지대사 과정 중에 불완전하게 환원되어 생성된 산물로서 superoxide anion (O2–), hydrogen peroxide (H2O2), 그리고 the hydroxyl radical (HO•)등을 일컫는다. 이 활성산소종은 free radical을 가져 안정되지 못한 상태를 말하며 그로 인해 강한 활성을 가진다. 활성산소 종은 생산이 과잉되면 생체에 대해 독성 즉, 산화적 손상(oxidative stress)을 가져온다 하여 유해산소라고 명명되기도 한다. 세포내의 단백질, 지질, 핵산등을 산화시킴으로써 세포의 항상성을 파괴하고 세포를 사멸시키는 등 세포조직 내에 치명적인 손상을 유발히며 일반적 노화와 관계가 있다. 하지만 연구가 진행됨에 따라 활성산소종이 낮은 농도에 있어 서는 세포 내 신호전달 반응에 관여하는 2차 신호전달 물질(second messenger) 임이 밝혀졌다. 이러한 2차 신호전달 물질은 오히려 유전자 발현, 세포 성장, 세포 분화, 분비, 세포 이동과 신경전달과정 등의 생리적 반응들을 유도하는 기능을 갖는다. 이러한 활성산소종의 생성 메커니즘은 Neutrophil, monocyte, macrophage와 같은 포식세포에 존재하는 NAD(P)H oxidase 2(Nox2, gp91phox) 의 연구를 통 해 밝혀지게 되었다. 이 효소는 두 개의 막 단백질인 gp91phox와 p22phox와 세 개 이상의 세포질 단백질들(p67phox, p47phox, p40phox, Rac1 or 2)로 이루어 져 있다. Nox2의 발견이래로 NAD(P)H oxidase에 대한 활발한 연구가 진행된 결과 포식세포뿐만 아니라 비포식세포에서도 Nox2의 다양한 유사체(Nox1, Nox3, Nox4, Nox5, Duox1, Duox2)가 존재함이 보고되었다. 이 유사체들은 구조상의 유사성에도 불구하고 발현되는 조직이나 효소 활성에 요구되는 보조인자의 종류, 생성하는 활성산소종의 양, 그리고 관련되는 생리학적인 기능 등에서 큰 차이를 보인다. Nox4의 경우 Nox2와 Nox1의 활성산소 조절에 관여하는 보조인자 단백질들이 Nox4가 활성산소를 생성하는 과정에 관련되어지지 않는다고 보고 되었으며 그 조절기작이나 구체적인 기능 또한 거의 밝혀지지 않은 상태이다. 다만 보고된 것은 막 단백질인 p22phox가 Nox4가 함께 있을 때 활성산소가 생성된다는 것이다. 따라서 우리는 Nox4와 상호 결합하는 단백질을 찾기 위해 Nox4의 C 말달 부분을 미끼로 사용하여 yeast two hybrid screening을 수행하였다. 그 결과 임의의 양성 클론 40개를 선별할 수 있었다. 클론들 중에서 SH3 domain containing Ysc84-like 1 (SH3YL1)을 target protein으로 정하여 실험을 진행하였다. 선행연구결과에 따르면 SH3YL1은 모발성장주기의 anagen 시기에 많이 발현되어 있다고 처음 보고되었고 northern blot 실험을 통하여 SH3YL1의 전사체가 피부와 더불어 신장, 위, 소장, colon에서 많이 발견된다는 것이 알려져 있다. SH3YL1은 구조적으로 SYLF domain 과 SH3 domain으로 이루어져 있고 이 SH3 domain은 Proline 많이 발현되어있는 Proline rich region과 상호작용한다는 것이 잘 알려져 있다. SH3YL1의 SYLF domain 은 인지질에 강하게 붙으며 dorsal ruffles 형성에 필수적인 것이 보고된바 있으나 아직 SH3YL1에 관한 기능이 거의 밝혀진바 없다고 할 수 있다. 이러한 SH3YL1단백질과 Nox4와의 결합을 Yeast two hybrid, GST pull down assay를 통하여 confirm하였고, 더불어 Nox1, Duox2와의 binding도 확인하였다. 특히 Nox4의 조절인자인 p22phox와도 SH3YL1이 결합한다는 것을 확인하였고 또한 SH3YL1의 어떤 domain이 결합하는지도 확인해보았다. 이런 Nox4와 p22phox, 그리고 SH3YL1의 상호 연결이 Nox4의 활성과 활성산소의 생성에 어떤 역할을 하는지를 알아보기 위하여 SH3YL1을 overexpression 과 knock-down 시켜 활성산소의 발생을 측정하였다. 결과를 모두 종합해 보았을 때, SH3YL1은 Nox4-p22phox 복합체와 결합하여 이들의 활성을 돕는 역할을 하는 조절인자임을 알 수 있다. ;활성 산소종(Reactive oxygen species, ROS)은 유기호흡을 하는 생물에게 있어 필수적인 산소가 세포 내의 효소 그리고 대부분의 전자 운반 과정 혹 은 에너지대사 과정 중에 불완전하게 환원되어 생성된 산물로서 superoxide anion (O2­), hydrogen peroxide (H2O2), 그리고 the hydroxyl radical (HO·)등을 일컫는다. 이 활성산소종은 free radical을 가져 안정되지 못한 상태를 말하며 그로 인해 강한 활성을 가진다. 활성산소 종은 생산이 과잉되면 생체에 대해 독성 즉, 산화적 손상(oxidative stress)을 가져온다 하여 유해산소라고 명명되기도 한다. 세포내의 단백질, 지질, 핵산등을 산화시킴으로써 세포의 항상성을 파괴하고 세포를 사멸시키는 등 세포조직 내에 치명적인 손상을 유발히며 일반적 노화와 관계가 있다. 하지만 연구가 진행됨에 따라 활성산소종이 낮은 농도에 있어 서는 세포 내 신호전달 반응에 관여하는 2차 신호전달 물질(second messenger) 임이 밝혀졌다. 이러한 2차 신호전달 물질은 오히려 유전자 발현, 세포 성장, 세포 분화, 분비, 세포 이동과 신경전달과정 등의 생리적 반응들을 유도하는 기능을 갖는다. 이러한 활성산소종의 생성 메커니즘은 Neutrophil, monocyte, macrophage와 같은 포식세포에 존재하는 NAD(P)H oxidase 2(Nox2, gp91phox) 의 연구를 통 해 밝혀지게 되었다. 이 효소는 두 개의 막 단백질인 gp91phox와 p22phox와 세 개 이상의 세포질 단백질들(p67phox, p47phox, p40phox, Rac1 or 2)로 이루어 져 있다. Nox2의 발견이래로 NAD(P)H oxidase에 대한 활발한 연구가 진행된 결과 포식세포뿐만 아니라 비포식세포에서도 Nox2의 다양한 유사체(Nox1, Nox3, Nox4, Nox5, Duox1, Duox2)가 존재함이 보고되었다. 이 유사체들은 구조상의 유사성에도 불구하고 발현되는 조직이나 효소 활성에 요구되는 보조인자의 종류, 생성하는 활성산소종의 양, 그리고 관련되는 생리학적인 기능 등에서 큰 차이를 보인다. Nox4의 경우 Nox2와 Nox1의 활성산소 조절에 관여하는 보조인자 단백질들이 Nox4가 활성산소를 생성하는 과정에 관련되어지지 않는다고 보고 되었으며 그 조절기작이나 구체적인 기능 또한 거의 밝혀지지 않은 상태이다. 다만 보고된 것은 막 단백질인 p22phox가 Nox4가 함께 있을 때 활성산소가 생성된다는 것이다. 따라서 우리는 Nox4와 상호 결합하는 단백질을 찾기 위해 Nox4의 C 말달 부분을 미끼로 사용하여 yeast two hybrid screening을 수행하였다. 그 결과 임의의 양성 클론 40개를 선별할 수 있었다. 클론들 중에서 SH3 domain containing Ysc84-like 1 (SH3YL1)을 target protein으로 정하여 실험을 진행하였다. 선행연구결과에 따르면 SH3YL1은 모발성장주기의 anagen 시기에 많이 발현되어 있다고 처음 보고되었고 northern blot 실험을 통하여 SH3YL1의 전사체가 피부와 더불어 신장, 위, 소장, colon에서 많이 발견된다는 것이 알려져 있다. SH3YL1은 구조적으로 SYLF domain 과 SH3 domain으로 이루어져 있고 이 SH3 domain은 Proline 많이 발현되어있는 Proline rich region과 상호작용한다는 것이 잘 알려져 있다. SH3YL1의 SYLF domain 은 인지질에 강하게 붙으며 dorsal ruffles 형성에 필수적인 것이 보고된바 있으나 아직 SH3YL1에 관한 기능이 거의 밝혀진바 없다고 할 수 있다. 이러한 SH3YL1단백질과 Nox4와의 결합을 Yeast two hybrid, GST pull down assay를 통하여 confirm하였고, 더불어 Nox1, Duox2와의 binding도 확인하였다. 특히 Nox4의 조절인자인 p22phox와도 SH3YL1이 결합한다는 것을 확인하였고 또한 SH3YL1의 어떤 domain이 결합하는지도 확인해보았다. 이런 Nox4와 p22phox, 그리고 SH3YL1의 상호 연결이 Nox4의 활성과 활성산소의 생성에 어떤 역할을 하는지를 알아보기 위하여 SH3YL1을 overexpression 과 knock-down 시켜 활성산소의 발생을 측정하였다. 결과를 모두 종합해 보았을 때, SH3YL1은 Nox4-p22phox 복합체와 결합하여 이들의 활성을 돕는 역할을 하는 조절인자임을 알 수 있다.