High throughput analysis of gene expression patterns in gastric cancer using SAGE and microarray techniques

Abstract

암은 진행과정에서 많은 생리, 생화학적 변화가 동반되며 이는 많은 유전자의 발현 조절의 인한 결과로 알려져 있다. 현재 암에 관한 연구는 암 조직에서의 차등적 유전자 발현 양상을 다량 분석하는 방향으로 serial analysis of gene expression(SAGE)법이나 microarray법을 이용한 예들이 널리 알려져 있다. 위암은 특히 우리나라에서 암으로 인한 사망의 원인으로 가장 많은 사례가 알려진 암이다. 본 연구에서는 위 정상 조직과 위암 조직에서의 분자 생물학적 기초연구의 하나로, 두 위암환자의 위 조직에 대해 SAGE 법을 적용하여 gene expression profile 을 작성하였다. SAGE 는 대량의 transcripts 를 정량·정성적으로 분석할 수 있는 expression analysis 방법으로 유전자의 사전 정보가 없는 경우에도 적용되어 조직에서의 총체적인 유전자 발현 양상을 알 수 있어 많은 위암 관련 유전자를 파악할 수 있다는 장점이 있다. 총 241.127 tag을 확보하여 암 조직에서 6배 이상 차등적 발현을 보이는 383개의 유전자를 대표하는 414개의 tag을 확보할 수 있었고, 두 위암 조직에서 공통적인 경향을 보이는 51개의 유전자를 확인하였다. 이 중 12개의 유전자는 발현 유도되었고, 39개의 유전자는 발현 억제되었음을 알 수 있었다. 많은 유전자들이 기존 결과와 상응하는 결과를 보였고, trefoil factor 3, regeneration gene type Ⅳ, gastric intrinsic factor, lactotransfer과 같은 새로운 위암 관련 유전자 후보를 발굴하였다. SAGE 방법을 통해 6 배 이상 발현 차이를 보이는 유전자를 선별하고 suppression subtract hybridization (SSH) 법을 적용하여 위암에서 발현 유도된 유전자에 대해 microarray 분석법을 적용하였다. SSH 방법은 발현 정도가 매우 낮은 유전자를 분석할 수 있어 SAGE 법의 결과를 보충해 줄 수 있다. SAGE 와 SSH 두 연구결과를 바탕으로 총 1744개의 유전자를 포함한 위암 연구를 위한 1차 specialized cDNA microarray 를 제작하였고, SAGE 결과에서 통계적으로 유의성(p＜0.01)이 높은 유전자 200여개를 추가하여 2차 위암 연구용 2차 specialized cDNA microarray 를 제작하였다. 특정유전자를 선별하여 제작되는 specialized microarray 는 다른 많은 장점보다 그 발현 특성이 확인되어 선정된 적은 수의 유전자를 사용함으로써 큰 효율성을 기대할 수 있다. SAGE data 와 동일한 환자 조직에서 분석해 낸 1차 specialized cDNA microarray 결과는 높은 반복성(R=0.85~0.94)을 보였으며, SAGE 결과와 비교하여 높은 상관관계(R=0.592)를 확인할 수 있었다. 두 실험결과를 통해 공통적으로 암 조직에서 차등적 발현을 보이는 124개의 유전자를 확인하였고, 더불어 44개의 기존 유전자 data base 에 보고되지 않은 새로운 유전자를 확인하였다. 이로써 위암 연구에 효과적인 specialized cDNA microarray 가 제작되었음을 확인할 수 있었다. 위암 관련 유전자들의 기능 탐색을 위해 6명의 진행성 위암 환자의 위암 조직과 각각의 정상조직을 대상으로 2차 specialized cDNA microarray 를 사용하여 microarray 분석을 진행하였다. 공통 reference RNA를 사용하여 정상 조직과 위암 조직을 실험한 결과 전체적인 유전자의 발현 양상이 정상 조직과 위암 조직을 뚜렷하게 구분하였다. 좀더 큰 차이를 보이는 유전자를 우선 분석하기 위해 Mann-Whitney test 를 통해 p≤0.005를 보이는 255개의 유전자를 확인하였다. 50%이상의 환자에서 2 배이상 차등적 발현을 보이는 유전자 중 26개의 유전자는 발현유도되었고, 117개의 유전자는 발현 억제되어 있었다. 이들 유전자 중에서 osteonectin, thymosin-alpha 와 같이 잘 알려진 유전자와 더불어 MIL septin-like fusion, RNA polymerase Ⅲ, follistatin-like 1, Zine finger binding protein 85, integrin 1, heterochromatin-like protein 1, G-rich RNA sequencing binding factor 1과 같은 새로운 위암관련 유전자를 발굴하였다. 더불어 63개의 기존에 보고되지 않은 새로운 유전자 또한 확인되었다. 본 연구는 위암 형성과정을 이해하는 새로운 많은 정보를 제공하고, 위암의 분석, 진단 및 치료의 유용한 새로운 유전자를 발굴하는데 크게 기여할 것이다.;Gastric cancer is a leading cause of cancer death in the world including countries such as Japan and Korea. In an attempt to understand the molecular bases of gastric cancer progression, the differentially expressed genes were analyzed in gastric cancer by serial analysis of gene expression (SAGE). Total 241,127 tags were obtained from four SAGE tag libraries constructed from two sets of gastric cancer and normal tissues. By comparing the tags from normal and cancer tissues, 414 differentially expressed tags, representing 383 genes, were identified in cancer tissues. Of the 414 tags, 50 tags were previously unidentified and potentially novel genes. Although each gastric cancer tissue revealed more than 200 differentially expressed genes compared to the respective normal tissue, the number of genes with consistent regulation patterns in both cancer tissues were 51 genes: 12 up-regulated and 39 down-regulated genes. The genes that showed consistent regulation patterns included well-known genes such as S100 calcium binding protein A14, collagen type IV, gastric intrinsic factor and lactotransferrin as well as a few novel candidates including Trefoil factor 3, regenerating gene type IV. Interestingly, the expression of several genes, such as osteoglycin, prostate stem cell antigen and histone deacetylase 3, was variable in the two normal tissues but similar in the cancer tissues. The expression profiles of these genes in normal tissues, possibly due to genetic background, could greatly affect individual sensitivity to cancer development and/or progression. Microarray analysis is an excellent method for rapidly screening large numbers of sequences, although the value of the information generated is limited to the choice. To maximize the useful information obtained from SAGE and suppression subtractive hybridization (SSH), a specialized cDNA microarray has constructed with the differentially expressed genes, which were identified by SAGE and SSH. Small, specialized microarrays have several practical advantages and can reveal information that is lost in the noise generated by irrelevant genes present in larger arrays. The gene expression pattern revealed with this specialized cDNA microarray are high reproducible (R = 0.85 ~ 0.94) and correlates well with the SAGE data (R = 0.592). By combining microarray and SAGE methods, 124 genes were identified as a common set of differentially expressed genes including 44 unidentified and potentially novel genes. Thus, this cDNA microarray, with appropriate set of genes, can be useful for molecular sketching of gastric cancer and for identifying genes that play crucial roles in the development and progression of gastric cancer. Lastly, to identify new gastric cancer related genes and the potential markers for prognosis and diagnosis of gastric cancer, the specialized cDNA microarray was applied to examine and analyze 6 advanced gastric cancer patients. The gastric cancer and corresponding normal tissues were successfully distinguished by gene expression profiling alone, indicating that array analysis using this specialized cDNA microarray can efficiently detect characteristics of gastric cancer. One hundred forty-three genes were identified to be consistently expressed in 6 advanced gastric cancers; 26 induced and 117 repressed genes. A number of novel candidates for gastric cancer-related genes such as MLL septin-like fusion, RNA polymerase III, follistatin-like 1, zinc finger binding protein 85, integrin 1, heterochromatin-like protein 1 and G-rich RNA sequencing binding factor 1 were added to well-known genes such as osteonectin, and thymosin-alpha. In addition, 63 unidentified and unknown genes were revealed. These findings suggest the usefulness of the procedure to select new candidates responsible for gastric carcinogenesis not easily detectable with conventional differential screening procedures. The data in these works would provide a new insight for understanding of cancer progression and potential new targets for the diagnosis, prognosis, and therapy of gastric cancers.