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석유탈황용 균주인 Gordona sp. CYKS1에 의한 DBT분해 특성 및 대량 생산방법 개발에 관한 연구

Title
석유탈황용 균주인 Gordona sp. CYKS1에 의한 DBT분해 특성 및 대량 생산방법 개발에 관한 연구
Authors
김윤정
Issue Date
2001
Department/Major
과학기술대학원 환경학과
Publisher
이화여자대학교 과학기술대학원
Degree
Master
Abstract
원유 속에는 황성분이 약 0.025-5% 정도 함유되어 있으며, 이러한 황성분은 많은 환경 문제를 야기시킨다. 원유의 정제과정에서 황성분을 제거하는 공정은 필수적인데, 현재 가장 널리 사용되는 방법은 수소를 첨가하는 수첨탈황법(hydrodesulfurization)이다. 수첨탈황법은 고압, 고온의 조업조건으로 인한 고가의 장치비와 운전비가 필요하며, 이 공정에 사용되는 촉매가 원유에 포함되어 있는 중금속에 의해 손상을 입기 때문에 탈황 효율면에서도 문제점이 있다. 최근 들어, 이러한 화학적 탈황 방법의 대처방안으로 미생물의 생리적 활성을 이용한 생물학적 탈황이 많은 연구자에 의해 주목받기 시작했다. 본 연구에서는 Gordona sp. CYKS1을 이용하여 석유내의 황을 제거하는 석유탈황에 관한 연구를 수행하였다. 특히, 석유탈황균주의 대량 생산과 공정 개발을 위해 균주의 생리학적 특성을 규명하였고 그 결과를 바탕으로 대량생산 가능성을 조사하였다. 또한 디젤 오일을 첨가하여 균주의 석유탈황능을 실제적으로 검토하여 보았다. 균주의 생리학적 특성조사에서는 균주의 DBT분해속도에 미치는 접종량, pH, 초기 DBT농도, 계면활성제, 2-HBP 및 2,2'-DHBP농도, sulfate, vitamin등의 영향을 알아보았다. 그리고 특히 대량 싱산 가능성을 확인하기 위해 여러 탄소원과 황원들을 변화시키면서 석유탈황용 균주 Gordona sp. CYKS1균주의 생장과 분해속도를 조사하였다. 본 연구에서 사용한 Gordona sp. CYKS1은 염색폐수로부터 분리하였고, 4S-pathway를 갖는 석유탈황용 균주이다. CYKS1의 생리학적 특성조사 결과는 다음과 같다. DBT 분해속도에 미치는 접종량의 영향을 조사한 결과 접종농도가 높아지면 지연기가 단축될 뿐 지수 생장기의 생장속도는 거의 유사하였다. 그러나 접종 농도가 높아질수록 DBT분해속도는 높아졌다. pH5-8사이의 범위에서 균주의 분해속도를 조사한 결과 pH 5와 6인 산성조건에서는 pH7, 8에서의 분해 속도보다 거의 50%이하로 낮게 조사되었다. 유일황원인 DBT의 초기 농도를 0.3-4.0mM까지 다양하게 변화시켜 첨가하였을 때 DBT 1.5mM까지는 분해속도가 증가하였으나, 0.5-4.0mM범위에서는 농도가 증가할수록 분해속도는 감소하였다. 최대 DBT 분해속도는 DBT 농도 1.5mM인 조건에서 12.5μmol·L^-1·h^-1였다. 또한, DBT는 물에 대한 용해도가 낮아 생물 이용성이 작은 물질이므로 DBT 이용성을 향상시키기 위해 계면활성제 tween 80을 첨가하여 분해속도와 생장속도를 조사하였다. 그 결과 생장속도와 DBT분해속도는 0.08h 및 3.9812.5μmol·L^-1·h^-1로 약 20-25%정도 향상됨을 확인할 수 있었다. 그리고, DBT나 그 유사체를 탈황할 수 있는 능력을 갖는 균주들은 2-HBP와 sulfate등과 같은 부산물에 의해 저해를 받는 것으로 알려져 있다. 따라서 본 연구에서도 DBT의 최종산물인 2-HBP와 그의 유사체인 2,2'-DHBP의 영향을 조사한 결과 2-HBP는 그 농도가 증가할수록 DBT분해는 저해를 받았으며, 2,2’-DBHP의 경우에도 유사한 경향을 나타내었다. 그러나, 2-HBP에 비해 2,2'-DHBP의 경우엔 그 저해 정도가 작았다. 또 다른 부산물인 sulfate의 영향을 조사한 결과 sulfate의 첨가량이 증가할수록 DBT분해능이 감소되었다. Sodium sulfate 0.1g/L이상에서는 DBT가 거의 분해되지 않았지만, 세포생장속도는 첨가량이 많을수록 증가하였다. 마지막으로 무기염 배지내에 포함된 비타민의 첨가여부가 DBT분해속도에 미치는 영향을 조사한 결과 비타민 첨가 여부에 상관없이 유사한 생장속도와 DBT분해속도를 나타내는 것으로 밝혀졌다. 앞서의 생리적 특성조사결과를 바탕으로 대량배양을 위해 최적의 탄소원과 황원을 조사하였다. 그 결과 sucrose가 0.04h^-1로 가장 높은 생장속도를 나타내었고, succinate, pyruvate, glucose, ethanol등이 우수한 생장속도를 얻을 수 있는 탄소원이었다. 황원으로는 magnesium sulfate 첨가시 0.076h^-1의 최대 성장속도를 나타내었다. MgSO₄, Na2SO₄, DBT를 황원으로 균주를 배양한 뒤 DBT를 분해시켜 보았을 때, DBT배지에서 전배양한 경우보다 sulfate에서 전배양한 경우에서 CYKS1 균주의 생장속도가 2배 이상 높았고, DBT 분해속도도 2배정도 빠른 것으로 조사되었다. 회분식 배양을 이용하여 CYKS1 균주를 고농도로 배양해 본 결과 탄소원으로 glucose를 60g/L첨가하였을 때 2.10h^-1의 높은 생장속도를 얻을 수 있었다. 특히 100g/L의 매우 높은 농도에서도 1.04h^-1의 높은 생장속도를 얻을 수 있었고 48.5g/L의 균체를 생산할 수 있었다. 또한 유가식 배양을 이용하여 고농도 배양하였을 때는 약 20시간 정도 지연기가 관찰되었지만 약 150시간동안의 배양동안 약 150g/L의 고농도 건조 균체량을 얻을 수 있었다. 이러한 특징을 갖는 CYKS1의 실공정에의 적용 가능성을 확인하기 위해 본 연구에서는 시판중인 디젤 오일을 배양액과 혼합하여 직접 회분식 배양하면서 시간에 따른 오일내의 유기황화합물의 농도 변화를 조사하였다. 처리하지 않은 오일의 황화합물 peak와 비교했을 때 처리시간이 결과함에 따라 황화합물 peak가 상당히 줄어드는 것을 확인할 수 있었다.;The crude oil contains sulfur around 0.025 - 5 percent, which in turn causes lots of serious environmental problem. To prevent this hazard sulfur removal is essential in the process of oil-refining. The most widely used way of sulfur removal is hydrodesulfurization which imbues hydrogen during the oil-purification. However hydrodesulfurization costs a lot of money due to its high operation and equipment cost as it needs high pressure and temperature condition during the whole process. Also catalyst used in the process is easily harmed by the heavy metal contained in the crude oil lessening the desulfurization efficiency. Recently to avoid these inefficiency, scientist who were searching for the substitute method began to show their attention to the biological way of desulfurization. In this study I worked the desulfurization of petroleum using Gordona sp. CYKS1. Especially, physiological characteristics of CYKS1 were confirmed for mass production and refining process development of microorganism desulfurizing petroleum. On the basis of these results I investigated the capability of mass production. Also, I checked the real desulfurization ability of Gordona sp. CYKS1 in the condition of culture by adding diesel oil as the sulfur source. Gordona sp. CYKS1 used in this work was isolated from dye waste slurry, which was found to be capable of desulfurizing DBT via sulfur-specific pathway(4S-pathway), which is considered to be advantageous due to no loss of fuel value. The dead-end metabolites of DBT were found to be 2-hydroxybiphenyl (2-HBP) and sulfate. About 0.25mM of DBT was entirely desulfurized in 60 hours in the minimal salt medium in which DBT dissolved in ethanol was added as a sole sulfur source(DBT/ethanol system). Almost equimolar amount of 2-HBP was produced. The two dead-end metabolites, 2-HBP and sulfate strongly inhibited the desulfurization activity of CYKS1. No desulfurization occurred over 0.2mM of 2-HBP. The strains CYKS1 could utilize ethanol as well as glucose as a carbon source. The optimal range of pH for desulfurization and cell growth was 7.0 to 8.0. The desulfurization rate decreased about 30% when the initial pH was 6.0, and no significant desulfurization was observed when initial pH was 5.0. Tween-80 was used for th e investigation of surfactant effect on desulfurization activity. The addition of Tween-80 enhanced the cell growth rate and desulfurization rate in the initial stage in DBT/ethanol system by increasing the solubility of DBT. The largest desulfurization rate was 12.5μmol·L^-1·h^-1 in initial DBT concentration 1.5mM and as DBT concentration increased from 1.5-4.0mM DBT desulfurizing activity of CYKS1 was inhibited. The most profitable sulfur and carbon source for high cell fermentation was sucrose and magnesium sulfate. Also Succinate, pyruvate, glucose, ethanol were good carbon source. Because the desulfruization activities of the strains Gordona sp. CYKS1 was known to be inhibited by 2-HBP and sulfates, two-stage fermentation strategy in which cell growth and desulfurization activity induction was separated was developed for the potential use in the mass production of cells. sodium sulfate or magnesium sulfate were used as a sole sulfur source in the cell growth stage, and DBT was used as a sole concentration in the desulfruization activity induction stage. Both the specific desulfurization rate and productivity were higher than that obtained when the cells were grown in the presence of DBT. CYKS1 growed well in the wide ranges of 10^-100g/L glucose concentration, for which enrichment culture over 100^-150g/L would be achieved easily without skillful treating and delicate equipment. Optimal concentration of glucose in batch culture was 60g/L, in which the highest specific growth rate was observed. In the fed-batch culture 150g/L dry cell was produced in 150 hours. These results proved to be carried out high cell mass production. When diesel oil added in the batch culture medium and desulfurization activity was tested using growing cell of CYKS1, sulfur content of treatment samples decreased with treating time compared to control.
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