Regulatory T cells regulating cytotoxic T cell responses

Abstract

Regulatory T cells (Treg) have emerged as one of the T cell populations playing important roles in immune regulation. In spite of the ongoing effort for characterizing Treg, it is not fully understood about their development, physical characteristics, mechanism of actions, and roles in the immune network. Most of the studies on Treg have been conducted in the context of autoimmunity but the possible involvement in variable immune responses is still open. To investigate the role of Treg in non-responsiveness state in murine system, C57BL/6 mice were used. C57BL/6 mice (H-2^b) do not generate cytotoxic T lymphocyte (CTL) responses to hepatitis B virus surface protein (HBsAg) although this antigen can induce the responses in other strains. Since it has been reported that there is no defect in antigen processing and/or T cell repertoire for HBsAg in this mouse strain, it is hypothesized that the Treg actively suppress the immune responses to HBsAg in C57BL/6 mice. CD4^+ CD25^+ T cell line was obtained from C57BL/6 mice by HBsAg immunization and in vitro restimulation. This cell line produced regulatory cytokines such as TGF-β and IL-10, and inhibited the proliferation and function of HBV-specific CTL clones in vitro. Furthermore, it reduced HBV-specific CTL frequency in vivo when adoptively transferred to syngenic mice. By immunizing the mice with recombinant HBsAg and recombinant vaccinia virus expressing HBV surface antigen (vvHBV) sequentially, it was confirmed that Treg function that could inhibit HBV-specific CTL responses were developed in vivo by HBsAg immunization. These data suggest that the non-responsiveness of C57BL/6 mice to HBsAg resulted from, at least in part, the inhibitory functions of the Treg. As a second part of the study, the role of Treg in tolerance maintenance was investigated using the HBV transgenic mice (HBV Tg). HBV Tg 50-4 strain is immunologically tolerant to the HBV antigens. Various vaccination strategies have been attempted but failed to break the tolerance in this mouse. Although the tolerance to HBV antigen is maintained, this mouse strain develops spontaneous liver disease beginning at the age of about 3 months. By immunization with vvHBV, immune response induction to HBsAg in the Tg was attempted, and different immunological responsiveness between 2-month-old and 5-month-old Tg was observed. In contrast to the unbreakable tolerance reported previously, both the CTL and the antibody response against HBsAg could be induced by the vvHBV immunization. Cytokine expression pattern and antibody isotype indicated that T helper 1 type immune response was induced. However, interestingly, these immune responses were observed only in the 5-month-old Tg, but not in the 2-month-old Tg. Furthermore, CD4^+ T cells from 2-month-old mice, but not those from 5-month-old mice, inhibited CTL response to HBV antigen when adoptively transferred to C57BL/6. These results suggest the possible involvement of Treg function in the HBV Tg for maintaining tolerance. These results would contribute to a better understanding of immune status of the HBV Tg as a model of human chronic hepatitis and to the search for new therapeutic targets for chronic viral infections.;조절 T세포 (regulatory T cell; Treg)는 T세포군에 속하며 면역 반응 조절에 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 계속되는 연구에도 불구하고, 이 조절 T 세포의 발달, 물리적 특성, 작용 기전, 면역 네트 워크에서의 역할을 포함한 많은 특성들이 아직은 밝혀지지 않은 상태에 있다. Treg 세포에 관한 많은 연구가 주로 자가 면역 반응에 관계하여 행해져 왔으나, 다른 다양한 면역 반응에 관여할 수 있는 가능성이 없지 않다. 본 연구에서는 C57BL/6마우스에 있어서 외부 항원에 대해 아무런 면역 반응을 일으키지 않는 무반응 (non-responsiveness) 상태에 Treg 세포가 작용하는지에 대한 조사를 해 보았다. C57BL/6 마우스는 H-2^b 타입의 MHC class I 분자를 가지고 있는데, B형 간염 바이러스의 표면 항원 (HBV surface antigen; HBsAg) 단백질에 대해 세포 독성 T 세포 (cytotoxic T cell; CTL) 반응을 나타내지 않는 것으로 알려져 있다. HBsAg 단백질은 타 종의 마우스에서는 CTL 반응을 유도하는 것이 보고되어 있다. 문헌에 발표된 바를 종합하여 볼 때, C57BL/6 마우스에 있어서 HBsAg 단백질에 대한 면역 반응에 필요한 T 세포 repertoire나, 항원을 T 세포가 인식 할 수 있는 상태로 처리하는 과정 (antigen processing pathway) 어느 곳에도 결함이 없음을 알 수 있었다. 따라서 이 마우스에 있어서 HBsAg 단백질에 대한 무반응 상태를 일으키는 원인들 중 가능한 한가지로 Treg 세포의 역할을 살펴 보기로 하였다. C57BL/6 마우스에 HBsAg 단백질을 투여하고, 일정기간 후 비장세포를 수집하여 생체 외 배양을 하였다. 어느 정도의 분리 과정을 거쳐서 얻어낸 CD4^+ CD25^+ T 세포가 Treg 세포가 생산하는 것으로 알려진 TGF-β와 IL-10을 생산하는 것을 확인하였다. 이 CD4^+ CD25^+ T 세포는 또한 HBsAg 중 일부를 인식하는 세포 독성 단일 클론 T 세포 (CTL clone)들의 증식과 기능을 억제하였다. 더욱이 마우스 생체 내에서 HBsAg에 대한 CTL의 유도가 이 CD4^+ CD25^+ T 세포를 생체 내 주입함으로써 억제된다는 것을 관찰하였다. 마지막으로 C57BL/6 마우스 한 개체 내에 HBsAg 단백질과 이 마우스에서 CTL 반응을 유도 할 수 있는 것으로 알려진 HBsAg 표현형 재조합 종두 바이러스를 시차를 두고 투여하여, HBsAg 단백질에 의해 CTL의 유도가 억제됨을 생체 내 시스템으로 관찰 할 수 있었다. Treg 세포의 역할에 관한 두 번째 연구로서, 면역 내성에 있어서의 Treg 세포 역할을 유전자 변형 마우스 (transgenic mouse; Tg)를 이용하여 관찰하고자 하였다. B형 간염 바이러스 항원(HBV antigen)을 간 세포에 발현하는 Tg 마우스 중 하나인50-4 마우스는 HBV antigen에 대해 면역 내성이 있다. 이 내성을 극복하기 위한 다양한 백신이 시도 되어 왔으나, 현재까지는 불가능 한 것으로 알려져 있었다. 이러한 내성을 유지하는 가운데, 이 종의 마우스는 생후 약 3개월이 되면 자발적 간 병변을 일으킨다고 보고되어 있다. 본 연구에서는 50-4 마우스에 HBsAg을 발현하는 재조합 종두 바이러스를 투여 하여 HBsAg에 대한 면역 반응을 유도해 보고자 하였고, 2개월 된 마우스와 5개월 된 마우스에서 서로 다른 결과를 얻을 수 있었다. 기존에 알려졌던 HBV antigen에 대한 내성에도 불구하고, 본 실험에서는 재조합 종두 바이러스의 투여로T세포반응은 물론 B세포 반응까지도 유도할 수 있었다. Cytokine의 생성 양식이나 항체의 isotype을 살펴보았을 때, 유도된 면역반응은 T helper 1 type의 반응이었다. 그러나 흥미로운 것은, 이 면역 반응 유도가 생후 5개월 된 마우스에서만 가능하고 2개월 된 마우스에서는 불가능 했다는 것이다. 두 마우스의 면역 반응에 있어서의 차이를 일으키는 원인을 알아보고자, 각 월령의 50-4 마우스로부터 CD4^+ T세포를 분리하여 다른 마우스에 주입한 후, 주입된 세포가 면역 반응 유도에 끼치는 영향을 살펴보았다. 그 결과, 생후 2개월 된 마우스의 세포를 주입 받은 마우스에 있어서 HBV antigen에 대한 CTL 반응이 저하되는 것을 관찰하였다. 이러한 결과들은 50-4마우스의 HBV antigen에 대한 내성을 유지하는데 있어서 Treg세포의 기능이 관여한다는 가능성을 보여준다. 이상의 결과는 HBV antigen을 발현하는 Tg 마우스의 면역 상태를 좀 더 정확히 이해하여 인간의 만성 간염 모델로 사용하는 데에 도움이 되고, 나아가 바이러스의 만성 감염을 치료하기 위한 새로운 목표를 제시할 수 있을 것 이다.