Sentrin과 상호 작용하는 단백질의 확인 및 sentrin 세포 내 기능에 관한 연구

Abstract

Sentrin은 101개의 아미노산으로 구성된 ubiquitin과 유사한 단백질로서 서열상으로는 ubiquitin과 18%의 동일성과 48%의 유사성을 가지고 있다. 이미 많은 연구가 이루어진 ubiquitin과 마찬가지로 posttranslational modification을 일으키는 단백질로서, sentrin 역시 생체 내 단백질의 기능 조절에 중요한 역할을 하리라 기대되고 있다. Sentrin은 ubiquitin과 비슷한 방식으로 target단백질에 결합하는데, ubiquitination에 사용되는 E1, E2, E3와는 차별적인 효소를 사용한다. E1으로는 Aos1p/Uba2p (yeast), Sua1p/hUba2p (human)가 사용되며, E2로는 Ubc9이 알려져 있다. 현재까지 알려진 sentrin의 substrate으로서 RanGAP1, PML, IκBα가 많이 연구되어 있으며, 계속해서 sentrin에 의해 modify되는 단백질들이 차례차례 발견되어지고 있다. 그러나 아직까지도 sentrin의 생체 내 기능에 대해서는 많은 부분들이 알려져 있지 않기 때문에 앞으로 이에 대한 연구가 많이 진행되리라 예상된다. 본 연구에서는 크게 세 가지 부분의 sentrin에 관한 연구를 진행하였다. 첫째로, 외부에서 어떤 stress가 주어졌을 때 sentrin이 세포 내에서 어떠한 기능을 하는지 알아보고자 하였다. 이를 위하여 sentrin을 세포 내에 과발현시키고 다양한 종류의 stress (heat shock, Fas ligand, H₂O₂)를 준 후 immunoprecipitation과 western blotting을 통하여 sentrin-modified protein을 조사하여 보았다. 그 결과 Fas ligand나 H₂O₂에 비해 heat shock을 준 경우 sentrin에 의해 modify되는 단백질이 의미 있게 증가함을 관찰할 수 있었고, 이러한 현상이 세포에 어떠한 영향을 미치는지 알아보고자 SAPK/JNK assay 와 MTT assay를 실시한 결과 sentrin을 과발현시킨 세포의 경우 그렇지 않은 세포에 비해 thermotolerant해짐을 알 수 있었다. 뿐만 아니라 이러한 현상의 분자적 기전을 알아보고자 ROS를 측정해 본 결과, heat shock에 의해 생성되는 ROS가 sentrin에 의해 block되는 결과를 보여 heat shock에 의한 ROS생성에 sentrin이 관여함을 보였다. 앞으로 정확한 작용기전을 확인하기 위한 연구가 계속 진행될 예정이다. 또한 heat shock을 주고 sentrin의 localization을 조사한 결과 heat shock에 의해 sentrin 및 sentrin-modified proteins의 세포 내 분포가 변화함을 확인할 수 있었다. 둘째로, sentrin과 상호 작용하는 단백질들을 proteomics를 이용하여 확인하고자 하였다. 먼저 Flag-sentrin을 HEK 293 cells에 transfection하고, immobilized Flag monoclonal antibody로 immunoprecipitation을 시행하였다. 그 후 2-dimensional 혹은 1-dimensional gel electrophoresis 와 MALDI-TOF MS를 이용하는 peptide fingerprinting에 의해 단백질을 identify하였다. 이 과정에서 sentrinization 즉 sentrin과 covalent bond를 형성하는 단백질과 그렇지 않은 기타의 상호 작용하는 단백질을 sentrin-specific mass peaks을 이용하여 구분할 수 있다는 것을 알게 되었다. 앞으로 이렇게 해서 찾은 단백질들과 sentrin과의 상관성에 대한 연구가 계속 진행될 예정이다. 또한 이러한 proteomics방법과는 별개로 yeast-two hybrid screening을 통하여 알게된 sentrin과 Nm23과의 상호작용을 mammalian cells에서 확인하는 실험을 진행하였다. 마지막으로, 본 실험실에서 확보하고 있는 placenta의 nuclear fraction에 존재하는 sentrin-specific protease를 확인하고자 하였다. 순수 분리한 sentrin과 placenta의 cytosol, membrane, nucleus fraction을 각각 incubation해보면 nuclear fraction에 의해서만 sentrin의 clevage가 일어남을 확인할 수 있었다. 이러한 sentrin-specific protease가 무엇인지 알아보고자 먼저 여러 가지 protease, caspase, proteasome inhibitor들을 처리하여 본 결과 cysteine protease임을 확인할 수 있었고, 또한 2-D 및 MALDI-TOF MS를 통하여 cleavage가 일어나는 site이 C-terminal 부분임을 알 수 있었다. 이러한 결과들로 미루어 볼 때 sentrin과 target protein과의 결합을 자르는 역할 뿐 아니라 sentrin의 C-terminal쪽의 Gly^96-Gly^97이후의 4개의 아미노산을 잘라내는 역할도 하는 것으로 알려진 desentrinization enzyme의 일종일 것이라 예상되며, 현재 ion exchange column chromatography 및 gel filtration column chromatography를 통해서 이 단백질을 분리하고 있는 중이다. 결론적으로 본 연구에서는 placenta에 존재하는 sentrin-specific protease의 확인, sentrinization의 target 단백질 및 상호 작용하는 단백질의 검색, 생리적 변화에 의한 sentrinization의 변화 및 그 기능에 대해 연구하고자 하였다.;Sentrin is a ubiquitin-like protein of 101 amino acids and it has 18% identity and 48% similarity with ubiquitin. Sentrin is expected to play an important role in regulation of cellular protein functions like ubiquitin which is well known to perform posttranslational modification. Sentrin can be attached to other proteins in a similar way to ubiquitin, but it use different E1, E2, E3 enzymes. Aos1p/Uba2p (in yeast) and Sua1p/hUba2p (in human) are used for E1 enzyme and Ubc9 is known for E2 enzyme in sentrinization. Substrates for sentrin modification have been identified, i. e. RanGAP1, PML, IκBα. But the studies about cellular functions of sentrin are insufficient. In this study, at first, we investigated cellular functions of sentrin when cells were exposed to different kinds of external stresses. For this study, we used HEK 293 cells or HeLa cells after sentrin overexpression. We examined sentrin-modified protein profiles when cells were exposed to heat shock, Fas ligand, and H₂O₂ by immunoprecipitation and western blotting. In particular, heat shock significantly increased sentrinized proteins. To figure out the cellular function of increased sentrinized proteins after heat shock, we performed SAPK/JNK assay and cell viability assay. These assay revealed that cells transfected with sentrin were thermotolerant than control cells. In order to find out the molecular mechanism of these thermotolerance, we measured ROS level in heat shocked cells. The result show that ROS formation by heat shock was inhibited by sentrin overexpression. Further study will be continued to find out the precise mechanism. In addition, we could identify that cellular distribution of sentrin and sentrin-modified proteins change after heat shock. Second, we identified the sentrin-interaction proteins by proteomics. HEK 293 cells were transiently transfected with Flag-sentrin and cell lysates were immunoprecipitated with immobilized Flag monoclonal antibody. Then the immunocomplex were subjected to 2-dimensional or 1-dimensional gel electrophoresis and proteins were identified by peptide fingerprinting with MALDI-TOF MS. In this process, we found out that sentrinized proteins (formation of covalent bond) and other sentrin-interacting proteins could be distinguished by sentrin-specific mass peaks. Relationships between these identified proteins and sentrin will be investigated continuously. In addition, we confirmed the interaction of sentrin and Nm23 in mammalian cells which was known by yeast-two hybrid assay. Finally, we tried to identify sentrin-specific protease in placenta nuclear fraction. Purified sentrin was cleavaged by nucleus fraction only when sentrin and placenta cytosol, membrane, nucleus fraction was incubated. To examine this sentrin-specific protease, sentrin-cleavage was detected after preincubation with various proteases, caspase, proteasome inhibitors. Only cysteine protease inhibitor blocked sentrin-cleavage. And we identified that the site of cleavage is C-terminus using 2-dimensional gel electrophoresis and MALDI-TOF MS. So we can postulate that this sentrin-specific protease is a kind of desentrinization enzyme which have roles in deconjugation of sentrin and breaking 4 amino acids of sentrin C-terminus. Now we try to purify this enzyme using ion exchange and gel filtration column chromatography.