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The binding partners of Lad, Lck-associated adaptor protein and LIME, Lck-interacting transmembrane protein

Title
The binding partners of Lad, Lck-associated adaptor protein and LIME, Lck-interacting transmembrane protein
Authors
박인영
Issue Date
2002
Department/Major
대학원 분자생명과학부
Publisher
이화여자대학교 대학원
Degree
Master
Abstract
세포 신호전달에 있어서 신호전달에 관여하는 단백질들의 세포내 이동 및 집합은 매우 중요한 의미를 지닌다. 예를 들면 면역세포 항원 수용체가 MHC와 같은 상대 수용체 및 기질과 결합했을 때, 여러 세포내 단백질들은 adoptor protein들이 매개하는 단백질-단백질 결합을 통해 세포막에 인접한 곳으로 모여든다. 최근에 발견된 Lad 와 LIME도 이들 adaptor 단백질 중 일부로서 T 세포 항원 수용체를 통한 여러 세포신호전달에 관여한다는 것이 밝혀진 바 있다. 이 논문에서는 Lad 와 lime이 주로 조혈세포 특이적으로 발현된다는 점에 착안하여 T cell lymphoma cDNA library를 이용해 Lad에 결합하는 단백질을 screening 하였으며 이들 단백질 중 JAB1과 vav 가 각각 Lad와 어떻게 세포 내에서 결합하며 T 세포 항원 수용체의 신호전달에 어떻게 연관되어 있는지 밝히고자 하였다. JAB1은 Lck kinase 의 작용이 없이도 Lad의 C-terminus에 결합함을 yeast two-hybrid system에서 확인하였으며, mammalian cell인 293T cell에서 overexpression 된 상태에서 또한 결합하는 것을 확인하였다. 현재 T 임파구에서 Lad 와 Jab1의 결합을 유도하는 stimulation조건을 탐색 중이다. Vav 역시 293T 세포에서 overexpession 되었을때 Lck kinase없이도 Lad와의 결합을 보였다. 또한 Vav의 단백-단백 결합을 유도하는 SH2 domain과 SH3-2-3 domain을 각각 Lad와 발현시켰을 때 Vav의 SH3 domain이 결합에 관여하는 것을 관찰할 수 있었다. Vav는 EL4 세포에서 어떤 자극도 주지 않은 상태에서도 Lad와 기본적으로 비교적 약한 결합을 보이고 있었으며, T 세포 항원 수용체를 UCTH-1으로 activation 시켰을때 결합하는 양은 크게 변화하지 않았다. 반면, pervanadate를 처리했을 때 vav와 Lad의 결합이 크게 증가하였다. 상기 결과를 통하여 Lad의 downstream 에 Vav가 관여함을 확인하였으며, 따라서 Lad-Vav 상호작용에 의한 cytoskeleton 구조 변화 조절에 관한 연구가 진행되고 있다. 한편으로는, LIME과 PLC γ1이 결합한다는 이전의 yeast two-hybrid 결과를 토대로 PLC γ1 과 LIME의 관계를 규명하는 실험을 수행하였다. 293T 세포에서 PLC γ1 은 Lck kinase에 의해 LIME이 인산화 되었을 때 결합하였다. 또한 PLC γ1 의 두개의 SH2 domain 내의 Arginine에 각각 돌연변이를 일으켜 비활성화 시켰을 때 N-terminal 쪽의 SH2 domain이 Lad와의 결합에 큰 기여를 하고 있었으며 C-terminal 쪽의 SH2 domain은 비교적 약하게 관여하는 것을 알 수가 있었다. 실제 Jurkat T 세포에서는 UCHT-1으로 activation을 주었을 때 약 2분만에 PLC γ1 과 LIME의 결합이 유도되는 것을 관찰하였다. 상기 결과를 통하여 LIME의 downstream signal 에 PLC γ1가 관여함을 확인하였다. LIME은 PLC γ1 와 결합 함으로써T 세포 항원 수용체의 신호전달에 의한 calcium signal 에 관여할 것으로 생각된다. 한편, LIME knockout mice 제조를 위한 transgene을 제작하고자 하였으며, genomic library의 스크리닝을 통하여 LIME genomic DNA를 판명하였으며, restriction enzyme site mapping 및 exon1의 위치를 밝히는 연구를 진행하였다. 연구결과는 knockout construct 제조에 사용되어 현재 외부와의 협조로 LIME knockout mice 제조가 진행중이다.;Multiple intracellular proteins are recruited via protein-protein interaction to the plasma membrane proximal region for the immune receptor signaling. Various signaling molecules were identified to interact with Lad in tyrosine phosphorylation-dependent yeast two-hybrid system. A total of 28 clones were selected in the yeast two-hybrid screening using the bait with Lad wild type fused to Lck kinase domain and 60 clones were selected using the bait with Lad C-terminus fused to Lck kinase domain. I demonstrate that Lad and LIME, recently identified haematopoietic specific adaptor molecules, are involved in recruitment several signaling proteins including Jab1 and Vav for Lad and PLCγ1 for LIME. The association of Lad with Jab1 was tyrosine phosphorylation-dependent. According to β-galactosidase assay, Jab1 interacted with the C-terminus of Lad. The interaction of Lad and Vav was also tyrosine phosphorylation-independent. According to the binding assay in 293T cells using truncated SH3-SH2-SH3 and SH2 domain of Vav, Vav was revealed to associate with Lad via its SH3 domain. In Jurkat T cells, Vav constitutively interacted with Lad regardless of TCR signaling. However, the interaction of Vav and Lad was highly increased upon pervanadate treatment in Jurkat T cells. This result implies that the interaction between Lad and Vav may be potentially enhanced further by an unidentified stimulus. In this experiment, it suggests that Lad may participate in the cytoskeleton reorganization and migration by the interaction with Vav in T cells. On the other hand, LIME associated with PLCr1 in a phosphorylation-dependent manner and the interaction was inducible upon TCR stimulation in Jurkat T cells. Unlike LAT, LIME was phosphorylated by Lck directly upon TCR engagement and interacted with SH2 domain of PLCγ1. It was revealed that both of SH2 domains of PLCγ1 were involved in the interaction with LIME. These indicate that LIME is involved in the proximal signaling events downstream of TCR engagement, and provide the possibility that LIME may involved in the Ca^++ signaling pathway downstream of TCR by interacting with PLCγ1.
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