Molecular mechanism of growth factor mediated ROS generation

Abstract

Recently, several lines of evidence indicate that growth factor induces the generation of reactive oxygen species (ROS), which function as second messenger in cellular proliferation. It is shown that the activation of PI3K and Rac1 protein are essential for ROS generation. Mitogenic oxidase (Mox), the homologue of gp91^phox of NADPH oxidase in phagocytic cells, is identified from fibroblast cells. However, the relationship between Mox and Rac1 is unclear. Here, we demonstrate that Mox interacts with active form of Rac1 protein in response to PDGF stimulation. Furthermore, Mox also interacts with βpix protein identified as a Rac1 guanine nucleotide exchange factor. Expression of C-terminal domain of Mox protein in 293T cells inhibits βpix-dependent ROS generation based on the observation of confocal microscope. This result suggests that Mox protein physically interacts with Rac1 and βpix to generate ROS in response to PDGF treatment. However, molecular mechanisms involving Mox, βpix, and Rac1 protein are integrated into physiological signal that leads for cellular proliferation remain to be elucidated.;활성산소종(Reactive oxygen species, ROS)은 외부자극에 의하여 세포막에 위치해 있는 NADPH oxidase 를 통해 생성되는 물질로 최근에 이차세포신호전달물질로서 연구되고 있다. 세포 내 생성된 활성산소종은 NF-kB, AP-1과 같은 전사인자 (transcription factor) 의 활성화, ERK, p38, JNK 등의 MAP Kinase 의 활성화, PLA₂, PKC, PLC 등의 활성 및 세포내부의 calcium변화, 세포사멸, 증식 분화 노화 등에 관여한다. 이런 활성산소종의 생성체계에 대한 연구는 주로 neutrophil, monocyte, macrophage 등과 같은 포식세포에서 이루어졌다. 포식세포 내에는 NADPH oxidase 를 통해 O₂^-, H₂O₂ 등의 활성산소종을 만드는데, 이 효소는 두개의 막 단백질과 (gp91^phox, gp22^phox) 세 개 이상의 세포질 단백질(p67^phox, p47^phox, p40^phox)로 구성되어 있다. 외부의 자극이나 침입에 의해 세포질 단백질이 막 단백질로 이동하여 complex를 이루어 전자의 이동이 이루어져서 활성산소종이 생성되게 된다. 또한 small GTP-binding protein인 Rac 단백질은 NADPH oxidase의 활성에 필수적인 역할을 한다. 최근에는 Rac(1or2) 단백질이 독립적으로 활성산소종 생성을 유도한다는 연구도 있다. 이런 활성산소종의 생성 연구는 포식세포 뿐 아니라 비포식세포에서도 이루어 지고 있다. 하지만 비포식세포에는 포식세포와 달리 완전한 NADPH oxidase complex를 가지고 있지 않다. 대신 부분적으로 포식세포에서의 세포질 단백질과 (p67^phox, p47^phox, p40^phox) 포식세포의 막 단백질인 gp91^phox와 유사한 다른 막 단백질 (Mitogenic oxidase1:Mox1) 을 가지고 있다. 최근에는 Mox라는 명칭대신 Nox (NADPH oxidase)를 사용하며 세포의 종류마다 다른 유사체를 가진다는 연구가 나오고 있다. Mox1은 colon, vascular smooth muscle, prostate, uterus, HepG2 cell 등에서 많이 발현되며 Mox의 과발현시 비포식세포에서 O₂^-의 생성 및 세포성장이 증가됨이 관찰되었다. 이 논문에서는 포식세포에서의 NADPH oxidase complex 을 바탕으로 Mox1를 가지고 비포식세포에서의 활성산소종 생성 메커니즘을 연구하였다. 최근 Ras 와 Rac (1 or 2)를 포함하는 small GTPase가 성장인자에 의한 활성산소종의 생성에 필수적이며. 비포식세포에서 활성산소종의 생성은 Rac 뿐 아니라 PI3-kinase 와 밀접한 관계가 있음이 보고되고 있다. 이를 바탕으로 Rac-GEF 로 알려진 βpix 가지고 PI3K를 의존한 활성산소종의 생성을 실험하였다. βpix는 Rac 의 GEF로서 Rac1 을 경유한 PAK의 활성이나 직접적인 PAK의 활성을 유도하여 MAP kinase를 활성 시켜 p38 활성을 통해 cytoskeletal rearrangement을 일으키는 물질이다. 본 실험에선 βpix가 자신의 여러 domain중 lipid 와 결합하는 PH domain 을 통해 PI3-kinase 활성의 부산물과 결합함으로써 활성산소종의 생성을 촉진함을 밝혀내었다. 비포식세포에서 βpix 에 의한 활성산소종의 생성이 Mox와 어떤 관계인지 알아본 결과 βpix는 Mox에 성장인자의 자극과는 상관없이 일정하게 결합되어 있었다. 또한 βpix 의 기능을 위해 Mox와의 결합이 필요함을 알아내었다. βpix 와 Mox 의 상관관계를 바탕으로 βpix 와 관련 있는 Rac1 및 PAK 과의 관계를 알아보았다. 실험한 결과 Rac1 이 Mox1의 C terminal 과 결합함을 찾아내었다. 이들의 결합은 성장인자에 의존적으로 증가하였으며 Mox와 결합하는 Rac1의 상태가 활성화된 상태(GTP-Rac1) 임을 관찰하였다. 또한 Mox는 PAK 과도 직접적으로 결합하고 있었다. 결론적으로 비포식세포에서 성장인자에 의한 Rac1의 활성이 Mox와의 결합을 유도하여 Mox를 통한 전자전달을 촉진시켜 활성산소종을 생성시키는 것이다. 또한 이 기작에서 Rac-GEF 인 βpix는 Mox와 항상 붙어있으면서, PH domain 을 경유하여 성장인자에 의한 PI3-kinase의 활성으로 인한 부산물(phosphatidyl-inositol 3,4,5-triphosphate (PI(3,4,5)P3)) 과 결합하여 활성산소종의 생성 및 MAP-kinase 활성 기능을 수행한다고 볼 수 있다.