ROS acts as a second messenger on differentiation of the human erythroleukemia K562 cells

Abstract

활성산소종(reactive oxygen species, ROS)은 singlet oxygen, superoxide anion radical (O2 -.), H₂O₂, lipid peroxide, nitric oxide, peroxynitrite(ONOO-), thiyl peroxyl radical (RSOO.) 등으로 높은 농도의 이들 활성산소종은 핵산, 지질 및 단백질의 생체 중요 화합물에 산화적 손상을 일으켜서 세포의 손상을 초래한다는 것이 잘 알려져 있다. 그러나, 최근 외부 신호에 의하여 특정지역에서 생성되는 낮은 농도의 활성산소종은 세포의 성장이나 분화 등의 조절에 관여하는 세포 내 이차 전달물질로 알려졌다. Human erythroleukemia K562 cell에 PMA를 처리하면 megakaryocyte로 분화가 되어지고 이 때 활성산소종이 생성된다. 이 논문에서는 세포의 분화가 일어날 때 PKC나 MAP kinase 등의 단백질 인산화 외에 활성산소종이 어떠한 영향을 미칠 것인지를 연구하였다. 세포 내에서 활성산소종의 계속적인 생성을 위해 해당과정을 거치면서 H₂O₂를 생성하는 glucose oxidase를 사용하였다. glucose oxidase를 처리한 K562 cell은 megakaryocytic cell surface marker인 CD41의 expression이 증가되었다. 그리고 활성산소종을 제거하기 위해 antioxidant인 NAC과 vitamin E를 처리한 결과 CD41의 expression이 감소되었다. 따라서 Human erythroleukemia K562 cell이 megakaryocyte로 분화될 때 ROS가 관여함을 알 수 있다. 또한 활성산소종은 K562 cell의 분화에 있어서 PKC의 활성과 MAP kinase 활성이 될 때 이를 촉진하는 기능을 하였다. K562 cell에 glucose oxidase를 처리하였을 때 PKC가 activation되었고, 반면에 PKC inhibitor인 GF109203X와 MAP kinase inhibitor인 PD98059를 처리했을 때 세포의 분화가 억제됨을 볼 수 있었다. 그러므로 PMA에 의해 생성된 활성산소종은 PKC가 membrane으로 translocation 될 때 관여하고 MAP kinase 활성에도 관여함을 알 수 있다. 또한 glucose oxidase에 의해 유도된 세포 분화의 형태는 PMA를 처리한 K562 cell에서와 유사하게 megakaryocyte와 neutrophilic myelocyte로 분화됨을 확인했다. 그리고 이 논문에서는 활성산소종에 의해 세포의 분화가 유도될 때 어떤 단백질이 관여하는지를 알아 보았다. 그 결과 glucose oxidase를 처리한 K562 cell에서 몇몇 단백질의 expression에 차이를 보였으며 그 단백질을 분석해 본 결과 각각 protein disulfide isomerase, heat shock protein 27, glyoxalase-1, hepatoma-derived growth factor (HDGF), T-complex protein 1, beta subunit and F1F0-type ATP synthase subunit D 임을 확인했다. 결론적으로, PMA를 처리한 K562 cell이 megakaryocyte로 분화될 때 PMA에 의해 생성된 활성산소종은 세포의 분화에 관여하고 또한 PKC와 MAP kinase의 활성을 촉진하는데 관여한다. 따라서 활성산소종은 Human erythroleukemia K562 cell의 분화과정에 있어 중요한 기능을 수행하며 이차 신호전달물질로서의 역할을 수행함을 알 수 있다.;Recently, several lines of evidence indicate that reactive oxygen species (ROS) can function as intracellular messengers. Treatment of K562 cells with 12-phorbol 13-myristate acetate (PMA) leads to megakaryocytic differentiation through the generation of ROS. To investigate the effect of ROS on cellular differentiation, we used the glucose oxidase (GO) system which continuously generates ROS in cells. Incubation of K562 cells with glucose oxidase resulted in increase of megakaryocytic cell surface marker, CD41. The differentiation was effectively inhibited by treatment with antioxidants, such as N-acetyl-L-cysteine (NAC) and Vitamin E. Moreover, ROS stimulates PKC activation and MAP kinase activation. The treatment of K562 cells with PKC inhibitor, GF109203X and MAP kinase inhibitor, PD98059, resulted in inhibition of cellular differentiation of cells. ROS induced differentiation of K562 cells to megakaryocyte as well as to neutrophilic myelocyte. To identity ROS-induced differentiation-associated protei ns, we treated with glucose oxidase at human erythroleukemia K562 cells for 24hr. Compared to control, glucose oxidase-treated K562 cells gene expression was changed. These results suggest that when PMA-induced signaling cascade was initiated by protein kinase C and MEK/ERK activation, ROS play important roles in cellular differentiation and acts as a second messenger on megakaryocytic differentiation of human erythroleukemia K562 cells.