Identification and mRNA expression level of Cysteine Proteinase Inhibitor (Cystatin; CPI) in mungbean (Vigna radiata L. wilczek) = 녹두에서 Cysteine proteinase inhibitor의 확인과 mRNA 발현양 분석

Abstract

녹두는 전 아시아 지역에서 재배되는 대표적인 콩과 작물로서 생산량의 50-60%가 재배 기간이나 저장 기간 동안에 팥바구미에 의해 손실되고 있다. 녹두에 감염하는 해충인 팥바구미는 여러 보고를 통하여 trypsin 같은 serine proteinase 보다 cysteine protinase를 사용하여 소화하는 것으로 확인되었고, 반면 사람이나, 다른 고등 동물들은 serine 계 proteinase를 사용하는 것으로 확인되었다. 따라서 cysteine proteinase는 콩류의 손실을 줄이기 위한 표적으로 그 중요성을 가진다. 본 연구에서는, 저항성 야생종인 V2709와 감수성 재배종인 전남 4호, 선화, 그리고 이들의 교배를 통해 새로운 품종으로 개발되어진 장안, 수원 29, 수원 30을 대상으로 cysteine proteinase inhibitor(CPI; cystatin)의 존재 유무와 그것의 발현 양의 차이를 알아보고자 CPI gene의 cDNA 염기서열 분석과 northern blot, quantitative RT-PCR 분석을 수행하였다. 1. CPI cDNA 유전자 염기 서열 분석 결과, 분석된 304bp의 cystatin은 저항성 종인 V2709, 장안 녹두, 수원 29, 수원 30, 그리고 감수성 종인 전남 4호와 선화 모두에 존재하는 것으로 밝혀졌다. 분석된 cystatin은 모든 식물 종뿐만 아니라 동물 종에서도 보존적인 Q-V-V-S-G의 아미노산 서열을 가지고 있으며, 식물 종에서 보존적인 P-W 의 아미노산 서열을 가지고 있다. 또한 2차 구조에서 α-helix, loop를 암호화하는 signal sequence를 포함하고 있었다. 이것은 분석된 녹두에서의 cystatin cDNA가 phytocystatin superfamily의 일원이라는 것을 나타낸다. 2. 저항성 종인 V2709, 장안 녹두, 수원 29, 수원 30, 그리고 감수성 종인 전남 4호와 선화의 cystatin은 서로 높은 유연 관계를 보였으며, PHYLIP 프로그램을 이용한 계통도 분석 결과, 크게 부모계가 하나의 그룹을 형성하고, 육종계가 다른 그룹을 형성하였으며, 각각 V2709, 전남 4호와 선화로, 장안 녹두, 수원 30종과 수원 29 종으로 다시 소 그룹을 형성한다. 이것은 cystatin 유전자가 바구미에 대한 저항성에 관련이 없음을 시사한다고 하겠다. 3. 장안 녹두에서 종자의 발달 단계에 따라 cystatin의 발현양이 어떻게 변화하는 지를 알아보기 위하여 Quantitative RT-PCR 과 northern blot analysis 분석을 수행한 결과, 다른 식물종과 마찬가지로 개화기 이후 2주 정도가 지난 종자에서 가장 많은 발현양을 보였으며, 그 발현양이 점점 감소하기는 하지만, 수확 후 저장 상태의 녹두 종자에서도 발현되고 있음을 확인할 수 있었다. 이것은 cystatin이 abiotic stress에 대한 저항 기작이라든지, programed cell death, 종자의 발아 등의 조절 기작에 관여하고 있다는 보고를 뒷받침 할 수 있다. 또한 2개의 bands가 발견되는 것으로 보아 녹두에서도 cystatin은 genefamiliy 로 존재할 가능성이 있다. 4. 저항성 종과 감수성 종을 대상으로 Quantitative RT-PCR 과 northern blot analysis를 수행한 결과, quantitative RT-PCR 분석에서는 감수성 종이 저항성 종 보다 약간 발현양이 적은 것으로 분석되었으나, 그 차이가 미미하였고, northern blot analysis 분석 결과, 거의 비슷한 발현양을 가지는 것을 알 수 있었다. 이것은 녹두에서 cystatin이 자연적인 바구미 저항성에 관련이 없음을 의미한다고 할 수 있다. 결론적으로, 녹두에서의 cystatin은 그 염기 서열 분석과 phylogenetic analysis 결과 phytocystatin이라는 superfamily에 속하며, 종자 발달 단계에 있어서 개화 후 2주 된 종자에서 가장 많이 발현되며, 그 양이 감소하기는 하지만 지속적으로 발현됨을 알 수 있었고, 저항성 종과 감수성 종 모두에서 발현되고 그 발현량에도 차이가 없었기 때문에 녹두의 바구미 저항성에는 관련이 없음을 증명하였다.;A major insect-pest of mungbean, Coleoptera utilizes aspartic and cysteinee proteinases for digestion rather than serine proteases such as trypsin. Whereas higher mammalian species use serine proteinase in their digestive systems, many insect species belonging to the Coleopteran and other orders widely utilize cysteine proteinase in digestion. Cysteine proteinases, a good target enzyme for inhibition growth and development of pests and cysteine proteinase inhibitor(CPI), cystatin, plays a important role in many aspects of plant development and resistance. To analyze for presence of the CPI gene in mungbean, RT-PCR was performed. cDNA that encodes a cystatin consisting of 89 amino acids was isolated and sequenced in both resistant cultivar type(V2709, Jangan, Suwon 29, Suwon 30) and susceptible cultivar type(Jeonnam, Seonhwa). The homology of CPI genes between resistant lines and susceptible lines was 90～95%. Its nucleotide sequences, especially Jangan mungbean's, are shown 95%, 86% and 74% homology compared with cowpea cystatin, oryza cystatin and soybean cystatin, respectively. Also, it contains the putative reactive domain QXVXG in the central part of the molecule and the PW motif near the COOH is terminus conserved among members of the cystatin superfamily. And, the predictive secondary structure, α1-helix domain is located 13 - 22 residues, loop 1 domain is located 40 - 50 residues, and loop 2 domain is located 63 - 71 residues. To characterize of expression level of cystatin mRNA in Jangan mungbean, northern blot and quantative RT-PCR were performed. The mRNA expression levels of Jangan mungbean reaches its maximum level 2 weeks after flowering and is expressed continuously during following maturation period. These results strongly suggested that mungbean cystatin is expressed in mungbean seeds during maturation and that the expressed protein. As the result of quantitative RT-PCR and northern blot analysis from resistant and susceptible lines, mature seeds of resistant mungbean lines and susceptible cultivar lines showed similar patterns and levels of expression. It is concluded that the level of expression of the cystatin do not account for the differences between bruchid resistance of the resistance lines and susceptible lines.