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Identification of Cysteine Proteinase Inhibitor (Cystatin; CPI) in mungbean (Vigna radiata[L.] wilczek) = 녹두에서의 Cysteine proteinase inhibitor 탐색

Title
Identification of Cysteine Proteinase Inhibitor (Cystatin; CPI) in mungbean (Vigna radiata[L.] wilczek) = 녹두에서의 Cysteine proteinase inhibitor 탐색
Authors
류다운
Issue Date
2002
Department/Major
대학원 생물과학과
Publisher
이화여자대학교 대학원
Degree
Master
Abstract
A major insect-pest of mungbean, Coleoptera is reported to utilize aspartic and cysteine proteinases for digestion rather than serine proteases such as trypsin. Cysteine proteinase inhibitors(cystatins) are protective proteins that inhibit cysteine proteinase of insects. To identify and charcterize the cystein proteinase inhibitor in mungbean, cDNA that encodes a cystatin consisting of 89 amino acid residues was isolated using RT-PCR and sequenced(GenBank No. AF454396). The cystatin sequences of resistant lines and susceptible lines, 4 lines of Suwon 28, Suwon 29, Suwon 30 and V2709 as resistant against C. Chinesis and Jeonnam 4 and Seonhwa as susceptible lines, show high similarity of 90-95%. Nucleotide sequence of Jangan mungbean(Suwon 28, resistant breeding line) shows 93%, 86% and 74% homology compared with cowpea cystatin, oryzacystatin and soybean cystatin, respectively. As shown in amino acid sequence, it contains the putative reactive domain QXVXG in the central part of the molecule and the PW mo tif near the COOH terminus which are conserved among members of the cystatin superfamily. By 3'-RACE PCR analysis, untranslated region of mungbean cystatin was analyzed and signal sequence analogues were found. So, it could be though that mungbean cystatin is a kind of secreted protein like corn cystatin, soyacystatin and carrot cystatin. As a result of Southern blot analysis using mungbean cystatin cDNA as a probe, 6 lines of mungbean genomic DNA show same band pattern with PstI, HindⅢ and XhoI. However, Suwon 29 shows different band pattern with BamHI and EcoRI. Cystatin gene families were detected in both resistant and susceptible lines of mungbean, therfore, it could be concluded that cystatin in mungbean exists for plant regulation rather than defense like the case of cowpea cystatin.;식물에 존재하는 여러 종류의 저항성 단백질 중 cystatin(cysteine proteinase inhibitor) 은 비교적 최근에 연구되기 시작한 단백질이다. 녹두의 대표적인 해충인 팥바구미가 소화를 위해 cysteine proteinase를 주로 사용한다는 사실이 보고되었으므로 이 소화효소의 경쟁적 저해제인 cystatin의 식물 내 존재 유무가 식물의 저항성에 중요하게 작용할 것으로 보인다. 녹두 내에서 cystatin의 존재를 확인함은 물론 녹두가 지닌 팥바구미 저항성과의 관계를 밝히기 위하여 저항성, 감수성 종 녹두가 비교 분석되었으며, 저항성 야생종인 V2709와 감수성 재배종인 전남4, 선화, 그리고 이 저항성과 감수성 종 사이의 교배를 통해 새로 개발된 녹두 품종인 수원 녹두(장안 녹두, 수원 29, 수원 30)가 재료로 사용되었다. 그러나 유전자 염기 서열 분석 결과 6품종 모두에서 cystatin이 분리되었고 그 서열이 90-95% 정도로 유사했다. Southern blot 결과에서도 모든 품종에서 cystatin gene family가 확임됨을 알 수 있었다. 그러나 6 품종을 BamHI으로 제한 절단 한 경우 수원 29의 band 양상에 차이가 보이며 EcoRI으로 절단 한 경우 수원 29, 30에서 차이를 볼 수 있었다. Membrane washing 시간을 짧게 한 경우 약하게 결합되는 더 많은 밴드들이 검출되는 것으로 보아 녹두 내에서 cystatin과 연관되는 유전자들이 존재하거나, 또는 쌀이나 옥수수의 경우처럼 cystatin 자체가 유전자 그룹으로 이루어져있을 가능성을 고려해볼 수 있으며 수원 29와 30은 28과 인트론 서열 내 차이가 있는 것으로 보인다. 분리된 녹두의 cystatin 단백질 서열은 모든 cystatin에 공통적인 Q-X-V-X-G 모티프와 P-W 모티프는 물론 식물의 cystatin에만 특이적인 L-A-R-F-A-V-x-E-H-N 서열을 지니고 있어 식물 cystatin 그룹의 구성원임이 확실히 증명되었다. 또한 다른 식물 cystatin과 마찬가지로, 그 서열은 동물 cystatin family II와 유사한 반면 이황 결합이 없다는 점에서 동물 cystatin family I과 유사하여, cystatin superfamily의 계통분류학 분석결과 동물 cystatin I-III 와는 별개로 다른 가지에 위치하게 된다. 대부분의 식물 cystatin이 이렇게 동물의 cystatin과는 계통분류도 상 독립적인 다른 위치에 놓이게 되나 아직 식물 cystatin이 따로 분류되거나 명명되지는 않은 상태이므로 더 많은 식물에서 cystatin이 분리되어 새로운 family로 분류되어야 함이 주장되고 있다. 3' RACE PCR 결과 녹두 cystatin 유전자의 아미노 말단 서열을 얻을 수 있었다. 옥수수(corn), 당근(Carrot)과 콩(soybean)의 경우 이 부분에 신호 서열을 가져 단백질 가공 과정 중 절단되어 나가며 성숙한 단백질이 분비되는 것으로 보고되어져있다. 녹두에서도 이와 유사한 서열이 발견되었으며 그러므로 분비단백질일 가능성이 보이나 세포 내 구획을 밝히기 위한 조직학적인 실험이 더해져야 할 것이다. 비록 녹두에서 cystatin이 팥바구미에 대한 저항성에 직접적으로 관여하는 것으로 보이지는 않으나, 저항성과 감수성 종간에 이와 비슷한 결과를 보였던 cowpea의 경우처럼, cystatin이 저항성보다는 식물 성장과 조절에 관여할 것이라고 생각할 수 있다. 동물의 경우에는 cystatin이 세포 사멸에 관여하는 것으로 알려져 있으며 1999년에는 콩의 cystatin도 이와 유사한 기전을 보이는 것으로 보고되었다. 또한 lima bean의 vicillin의 경우처럼 cystatin이 단독적으로 작용하는 것이 아니라 여러 가지 저항성 단백질이 복합적으로 작용하여 저항 기작을 나타내는 경우를 고려해 볼 수 있다. 그러나 정확한 결과를 위해서는 더 많은 식물에서 연구가 이루어져야 할 것이다. 현재 가장 잘 밝혀진 쌀의 cystatin이 여러 형질 전환 식물에 유전자 도입되어 뛰어난 해충 저항성을 보이고 있으므로 유전자 조작에의 이용 가능성도 매우 밝다고 할 수 있다.
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일반대학원 > 생명·약학부 > Theses_Master
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