Camptothecin과 B-lapachone에 의한 혈관세포 사멸 기전 연구

Abstract

Endothelial cell (EC)과 pericyte는 혈관세포를 구성하는 대표적인 세포이다. 당뇨병의 2차 합병증 중의 하나인 당뇨병성 망막증의 초기상태에 pericyte만이 선택적으로 소실되는 특성이 밝혀짐에 따라, 이들 두 세포는 외부환경으로부터 세포의 사멸에 다른 기전을 가지고 있음을 추측할 수 있다. 본 논문은 apoptosis를 일으키는 물질로 잘 알려진 camptothecin (CPT)과 β-lapachone (β-Lap)을 이용하여 이들 두 세포에서의 사멸기전에 대하여 조사하였다. 실험에 필요한 EC (bovine aortic endothelial cell, 이하 BAEC)는 소의 대동맥으로부터, pericyte (bovine retinal pericyte, 이하 BRP 및 rat omental microvacular pericyte, 이하 ROMP)는 소의 안구 및 쥐의 복강 내 지방조직에서 primary culture 하여 얻었으며, 광학현미경과 면역 세포 화학 염색법을 이용하여 세포의 성장 형태와 세포 특이 단백질을 조사함으로써 두 세포의 purity를 결정하였다. Cell viability (death)는 MTT assay으로 조사하였으며, 두 약물에 의한 세포의 형태적 변화와 DNA fragmentation assay, PARP (poly(ADP-ribose) polymerase) cleavage 및 annexin V/PI (propidium iodide) staining을 통한 생화학적 관찰을 통해 세포사멸이 apoptosis 혹은 necrosis에 의한 것인지를 조사하였다. 또한 특별한 경우에는 세포차원에서의 당뇨병성 망막증의 모델을 만들기 위해 고농도 (30 mM)의 glucose를 이들 세포에 7일 이상 처리하여 두 세포의 사멸에 미치는 고농도의 glucose의 효과를 조사하였다. 본 연구의 결과, CPT는 BRP와 ROMP에서는 cell death를 일으키지 않았으나 BAEC에서는 유의성 있게 cell death를 일으켰다는 것을 apoptosis의 특징과 함께 MTT assay를 통하여 보여주었다. 그러나 β-Lap는 MTT assay 결과 EC와 pericyte 모두에서 세포사멸을 일으키는 것으로 나타났으나 흥미롭게도 세포의 형태적 변화나 생화학적 변화에 의한 결과는 대조군 세포와 거의 차이가 없었다. 이러한 결과는 MTT assay가 세포의 death를 판단하는 절대적인 방법이 아닐 수 있음을 시사한다. 고농도의 glucose에서 자란 BAEC는 CPT에 의한 cell viability가 정상 농도의 BAEC와 비교하여 유의적으로 낮았다. 이는 CPT의 작용이 세포의 분열기에 더 왕성하다는 앞선 보고를 통해, 고농도의 당에 의해 BAEC의 증식이 크게 둔화되었기 때문으로 추정하였다. CPT의 생체 내 target인 topoisomerase-I (topo-I)은 세포의 증식과 밀접한 관계를 가지며 topo-I의 발현정도는 pericyte가 EC보다 낮은 것으로 나타났다. 이 결과는 pericyte가 CPT에 의해 death를 일으키지 않는 (CPT에 resistant한) 이유를 설명할 수 있다. 마지막으로 CPT와 β-Lap에 의한 세포 내 H₂O₂의 생성의 차이를 살펴보았다. EC에서는 CPT와 β-Lap에 의해 death를 일으키지만 H₂O₂의 생성이 일어나지 않았으며 BRP와 ROMP에서는 β-Lap에 의해 각각 2배와 2.6배의 H₂O₂를 생성하였다. 결론적으로 EC와 pericyte는 CPT와 β-Lap에 의한 세포사멸에 상당한 차이를 보이며 이 차이는 세포의 증식과 topo-I의 발현 또는 H₂O₂ 발생과 밀접한 관계를 가지고 있는 것으로 추정된다. 이러한 두 혈관세포의 사멸기전의 차이는 당뇨병, 암 등에서 보여지는 신혈관 생성으로 인한 질환을 예방, 치료할 수 있는 분자생물학적 근거를 제공할 것으로 예상된다.;The vascular system consists of two predominant cell types; endothelial cells (EC) and pericytes. Early stage of diabetic retinopathy is characterized by a selective dropout of pericytes in retinal capillary, suggesting that EC and pericytes have different cell death mechanisms in response to the various stimuli. In this paper, we investigated the mechanisms of camptothecin (CPT) and β-lapachone (β-Lap) on the vascular cell death. Bovine aortic endothelial cells (BAEC), bovine retinal pericytes (BRP), and rat omental microvascular pericyte (ROMP) were isolated. Cells were identified their purity by morphological characteristics and immunocytochemistry. Cell viability (death) was determined by MTT assay. Furthermore, DNA fragmentation assay, Western blot analysis, and flow cytometry were used to dissect between apoptosis or necrosis pathway. In a typical experiment, cells were grown in high (30 mM) glucose over 7 days to mimic the diabetic retinopathy, and, thus, the effect of high glucose on the apoptosis of EC and pericytes was also studied. Our study showed from MTT assay that CPT significantly induced the viability of BAEC, but not of BRP and ROMP. The reduction of BAEC viability was attributed to the apoptosis. β-Lap significantly induced the viability of both BAEC and pericytes by MTT assay, however, neither apoptosis nor necrosis in pericytes were found by morphological and other biochemical analyses such as DNA fragmentation, PARP cleavage, annexin V/propidium iodide staining (FACScan). These results indicated that MTT assay alone might overestimate the determination of cell death for some experiments. BAEC grown in high glucose over 7 days were shown to be resistant to CPT-induced cell damage in comparison with BAEC in normal glucose. This result might be due to the significant growth inhibition of BAEC by long-term high glucose exposure. The expression levels in two cell types of topoisomerase-I (topo-I), an intracellular target of CPT and an enzyme related to cell growth, were also measured. Little expression of topo-I in pericytes was found. This result might account for the inability of pericyte death by CPT. Lastly, we investigated that intracellular H₂O₂ production by CPT and β-Lap. Although CPT and β-Lap induced cell death in BAEC, both chemicals did not H₂O₂ production. In BRP and ROMP, however only β-Lap, not CPT, induced H₂O₂ production by 2 fold and 2.6 fold, respectively. In conclusion, the alteration in viability of EC and pericytes by CPT and β-Lap were significantly different. These differences might be attributed to the different patterns of cell growth, basal topo-I expression and two chemical-induced H₂O₂ production (thereby oxidative stress-reducing power) of EC and pericytes. This study provides the cellular and molecular biology basis to understand the pathogenesis of vascular problems regarding diabetes mellitus, cardiovascular diseases, and cancers.