총알고둥(Littorina brevicula)에서의 Metallothionein-like Copper-Binding Protein의 분리정제와 Maldi-TOF MS를 이용한 Metallothionein의 C-terminal sequencing

Abstract

아시아산 고둥인 총알고둥을 150 ㎍/L 농도의 CuCl₂에 노출시켜 Metallothionein과 유사한 성질을 지닌 구리결합 단백질을 분리하였다. 아가미, 신장, 생식선, 소화선 조직에서 20 mM의 β-mercaptoethanol이 있는 상태에서 얻은 상등액을 열처리하여 Sephacryl S-100 컬럼으로 분리하였다. 구리함량 분석결과 두 개의 구리 peak 가 있었는데 대부분의 구리와 결합하고 있는 부분을 모아 DEAE-sepharose anion exchange chromatography 와 C18 reverse-phase high performance chromatography로 더 정제하여 SDS-PAGE 상에서 homogeneity를 확인하고 Matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry (Maldi-TOF MS)로 정제된 단백질의 분자량을 측정하여 11.4 kDa이 나타났다. 한편으로 선행된 연구에서 분리된 9.8 kDa의 분자량을 가지는 총알고둥의 Cadmium-metallothionein (Cd-MT)을 carboxypeptidase Y (CPY) digestion과 Maldi-TOF MS을 이용한 방법으로 카르복실기 말단 서열을 결정하여 부분 서열을 알아냈다. 본 연구에서는 처음으로 CPY와 Maldi-TOF MS을 이용한 modified된 방법으로 5 kDa 이상의 단백질 특히, Cd-MT와 같이 시스테인이 전체 아미노산 구성의 20%인 시스테인 함량이 높은 단백질의 카르복실기 말단 서열 법에 적절한 조건을 찾아냈다. 다이설파이드결합 (disulfide bond)을 환원시키기 위해서, Cd-MT를 0.5M DTT (pH 5.2)로 처리를 한 뒤, 일반적으로 5 kDa 이하의 작은 단백질을 서열을 결정할 때 사용하는 농도 보다 20-50배 높은 농도인 20 pmol CPY로 digestion 시켰다. DTT의 첨가는 CPY의 digestion 효율을 증가시켰다. 결론적으로 본 실험에서는 5 kDa 이상의 고분자 단백질 서열분석 시 카르복실기 말단 서열결정법에 적절한 새 조건을 확립하였다. 산성환경과 매우 높은 농도의 CPY가 필요하다고 결론을 내릴 수 있다. 실험 결과 Cd-MT의 카르복실기 말단 부분 서열에 Cys-Xaa-Cys의 motif가 나타나는데 이것은 전형적인 MT의 특징이다.;Metallothionein-like Copper-Binding Protein (MT-like Cu-BP) was purified from Asian periwinkle Littorina brevicula, exposed to 150 μg/L CuCl₂ for 60 days. Heat-treated supernatant of gill, kidney, gonad and digestive gland tissue applied to gel-filtration chromatography on Sephacryl S-100 column in the presence of 20 mM β-mercaptoethanol. There are two copper containing peaks and the major peak was further purified by DEAE-sepharose anion exchange chromatography and C18 reverse-phase high-performance liquid chromatography. Molecular weight of the purified protein was determined by matrix-assisted laser desortion ionization time of flight mass spectromatry (Maldi-TOF MS) shown to 11.4 kDa. And the C-terminus of 9.8 kDa Cadmium-metallothionein (Cd-MT) purified from Littorina brevicula in previous study was partially sequenced by combination approaches of carboxypeptidase Y (CPY) digestion and Maldi-TOF MS. We found appropriate condition for modifed C-terminal sequencing method over 5 kDa protein, especially cysteine-rich protein like Cd-MT (20% of total protein) in our experiment. To reduce disulfide bond, Cd-MT was treated with 0.5M DTT (pH 5.2) and digested 20 pmol CPY which was 20-50-fold higher than usually used for sequencing small molecular protein molecular mass under 5 kDa. Addition of DTT increased CPY efficiency. Consequently, we established a new condition for C-terminal sequencing method over 5 kDa protein. we conclude acidic condition and very high concentration of CPY were required. Partial c-terminal sequence of Cd-MT showed Cys-Xaa-Cys motif, and it is main characteristic of MT.