팥바구미 gpdh의 분리 및 염기서열 분석

Abstract

저장성 콩류인 녹두, 팔 등의 해충 중에서 팔바구미(Callosobruchus chinensis)는 아시아 전역에 걸쳐서 가장 큰 영향을 미친다고 알려져 있다. 그러나, 현재 팔바구미에 대한 gene level에서의 연구는 미비한 상태이며, 그 해충의 생물학적 방제를 위한 기초적 지식도 부족한 상태이다. 따라서, 곤충의 물질대사에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있는 GPDH 효소를 연구대상으로 삼았다. 본 연구에서는, 노랑 초파리의 Gpdh를 probe로 하여 genomic library를 screening하고 그 인자의 exon 부분에서 primer를 고안하여 PCR을 수행함으로써, 팔바구미 의 Gpdh sequence를 밝혔다. 그 결과 밝혀진 5,126bp 길이의 인자는 1개의 5' non-translated region, 8개의 exon, 7개 의 intron과 3개의 3' non-translated region으로 구성되어 있다. 전체적인 exon 과 intron의 구성은 노랑초파리에서와 동일하지만, intron이 없는 Locusta migratoria와는 달랐다. transcription start site는 exonl 개시코돈의 140bp upstream 부분에, TATA box와 CAAT box는 그 transcription start site의 upstream에 위치해 있다. 그리고 exon6, 7, 8의 각각 3' 끝부분에 위치하는 종결코돈과 polyadenylation signal(AATAAA)이 확인되었는데, 그것은 팔바구미의 GPDH isozyme도 3' exon 부분의 alternative processing과정을 통해 형성됨을 보여준다. 노랑초파리의 Gpdh와 비교했을 때, 전체 염기서열의 유사성은 75.4%이고 coding region에서의 유사성은 84%이다. 그리고 intron은 70%의 유사성을 보였다. 전반적인 팔바구미와 노랑초파리의 Gpdh 염기서열분석을 통하여, exon 에서는 높은 유사성을 intron에서는 낮은 유사성을 나타냄을 알 수 있다. exon의 경우에는 exon1과 exon2의 유사성이 각각 71.7%와 63.7%로서, 비교적 많은 insertion/ deletion과 치환을 보였고, 그에 비해 다른 exon들은 높은 유사성을 보였다. intron의 경우에는, 특히 다른 intron이나 노량초파리에 비해, intron2의 길이가 짧고 insertion/ deletion의 발생빈도가 높음을 알 수 있다. 팔바구미 염기서열로부터 GPDH의 아미노산 서열을 추론하여 노랑초파리와 비교하면 전체 유사성은 85.2%이다. 다른 부분에 비해, exonl과 2에서의 유사성이 치환으로 인하여,특히 낮음을 알 수 있었다. 그리고 노랑초파리의 isozyme인 -1, -2, -3와 비교해보면/ 염기서열에서는 각각 84%, 83%, 82%의 유사성을 보였고 아미노산 서열에서는 84%, 83.9% 그리고 82.8%의 유사성을 보였다. 이것으로 팔바구미에서도 노랑초파리와 비슷한 phenotype의 isozyme이 발견되리라 생각된다.;Sn-Glycerol-3-phosphate dehydrogenase (GPDH: NAD^+ 2-oxidoreductase, EC 1.1.1.8), the enzyme playing a central role in the intermediary metabolism of insects, was subjected to study the gene blocking metabolism of C. chinensis. In the present study, we isolated and sequenced the Gpdh of C. chinensis using both screening with 8Kb Drosophila melanogaster Gpdh gene and PCR amplifications with primers designated from D. melanogaster exon regions. The 5,126bp gene obtained is comprised of one 5' non-translated region, eight exons, seven introns and three 3' non-translated regions as proposed in D. melanogaster. In insecta, its exon/intron organization is identical to that of D. melanogaster, but different from that of Locusta migratoria which has no intron. A single transcription start site was detected at 140bp upstream of ATG initiation codon in exonl. TATA and CAAT boxes are present upstream of the transcription start site. The stop codon(TAA) and polyadenylation signal(AATAAA) are located at the 3' end of each of the exon6 to 8. These findings show that GPDH isozymes in C. chinensis are produced by alternative processing of 3' exons. Comparison of the sequence with that of D. melanogaster showed 75.4% identity in the entire nucleotide sequence and 84% in the coding region. And the intron shows 70% identity to D. melanogaster. The sequence homology of the entire Gpdh between C. chinensis and D. melanogaster is high in the exon and low in the intron. In the case of exons, the identities of exonl and 2 show 71.7% and 63.7%, respectively. On the contrary, the exon3 to 8 shows high homology. Considerably, the length of intron2 is shorter than that of D. melanogaster and the frequency of occurrence of the insertion/deletion seems higher than other introns. We deduced amino acid sequence of GPDH and the overall homology is 85.2% compared with D. melanogaster. The homology of exonl and 2 is lower than others. In comparison with GPDH-1, 2 and 3 isozymes of D. melanogaster, the identity of nucleotide sequence is 84%, 83% and 82% and that of amino acid sequence is 84%, 83.9% and 82.8%, respectively. It describes that similar phenotypes of GPDH may be produced in C. chinensis.