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dc.contributor.author김지원-
dc.creator김지원-
dc.date.accessioned2016-08-26T12:08:57Z-
dc.date.available2016-08-26T12:08:57Z-
dc.date.issued2000-
dc.identifier.otherOAK-000000071291-
dc.identifier.urihttp://dspace.ewha.ac.kr/handle/2015.oak/189891-
dc.identifier.urihttp://dcollection.ewha.ac.kr/jsp/common/DcLoOrgPer.jsp?sItemId=000000071291-
dc.description.abstractKinesin은 미세소관을 따라 막성 소기관 등을 실어 나르는 motor protein으로 최근 까지 100가지 이상의 종류가 균류로부터 사람에 이르기까지 동정되었다. 이렇게 많은 kinesin이 왜 존재해야 하는 지는 아직 알려져 있지 않지만, 각각의 kinesin 별개의 다른 member들이 특이한 세포적 기능을 할 것으로 짐작된다. 쥐의 뇌에서 처음 분리된 KIF4는 kinesin superfamily의 한 종류로서 미성숙 신경세포나 다른 세포에서 plus end 방향성을 가지며 막구조를 가진 세포 소기관을 미세소관을 따라 세포막 쪽으로 수송한다고 알려졌지만 그것들이 어떤 세포 소기관인지는 아직 정확히 알려진 것이 없다. 그래서 KIF4가 결합하는 단백질이 무엇인지를 밝혀내는 것이 기능을 알기위한 첫 걸음이 될 것이다. 본 논문에서는 human KIF4 단백질을 사용하여 human KIF4와 결합하는 세포 단백질을 분리하는 실험을 수행하였는데 이를 위해 효모의 유전적 특성을 이용한 yeast two hybrid system을 사용하였다. 분리한 유전자를 확인하고 DNA 염기서열 결정과 함께 유전자 은행에서 기존의 유전자 염기서열과 비교 분석한 결과 모두 19개로서 5종류의 단백질 발현 유전자가 제시되었다. 그 중에서 fibrinogen α-chain과 일치한 12개의 clones 중 하나인 X22 clone과 Trio와 일치한 X15 clone을 E coli에 옮겨 단백질로 발현시켰으며, in vitro에서도 human KIF4와의 결합이 일어남을 immunoprecipitation으로 확인하였다.;Kinesin is an anterograde motor protein moving along microtubule for transporting membranous organelles. So far, about 100 kinesin isologs have been identified from various species ranging from fungi to human. A question of why so many kinesins exist remains elusive, however, it is highly likely that each member of kinesin performs particular cellular function. KIF4, originally isolated form mouse brains, is a member of kinesin superfamily(KIF). It is suggested that it has microtubule plus end direction and transport membranous organelle to membrane in juvenile neurons and other cells. The identify of the membranous organelle is unknown. Therefore, one of issues raised concerning the function of KIF4 is to identify its target proteins. The purpose of present study was to isolate human KIF4-interacting protein, employing yeast two-hybrid system. It was successful to isolate human KIF4-interacting protein, to sequence the gene and to compare the sequence the gene and to compare the sequence with existing ones. This resulted in obtaining 19 homologous clones. Among of them, Trio (X15) clone and fibrinogen a-chain (X22) clone which is one of twelve redundant clones are selected. Selected two clones in the yeast were transferred to E. coli system , followed by bacterial expression for immunoprecipitaion assay. Two proteins expressed in E. coli were found to bind in vitro with human KIF4.-
dc.description.tableofcontents논문개요 I. 서론 = 1 II. 실험 재료 및 실험 방법 = 6 1. Yeast Two-Hybrid Screening = 6 1) Competent yeast cells의 준비 = 6 2) Yeast 안으로의 bait plasmid의 transformation = 6 3) Yeast 안으로의 library plasmid의 sequential cotransformation = 7 4) β-galactosidase filter assay = 8 2. 결합 단백질 clone의 분리 = 9 1) Positive clone isolation = 9 2) Yeast plasmid miniprep = 9 3) E. coli plasmid miniprep = 12 3. DNA sequencing = 12 4. SFY526 yeast strain을 이용한 β-galactosidase liquid assay = 12 1) SFY526 yeast strain으로의 transformation = 12 2) β-galactosidase liquid assay = 13 5. GST fusion system을 이용한 유전자 발현 = 14 1) DNA cloning = 14 2) 발현된 단백질 확인 = 14 6. Immunoprecipitation assay = 15 1) Fusion protein의 large-scale purification = 15 2) HeLa total cell extract의 준비 = 15 3) Immunoprecipitation = 16 4) Western blotting = 16 III. 실험결과 = 18 1. Two-hybrid system을 이용한 human liver cDNA library screening = 18 2. 선별된 결합 단백질 clone의 분리 = 19 3. cDNA 염기서열 결정 및 분석 = 19 4. 선별된 결합 단백질에 대한 β-galactosidase liquid assay = 21 5. 단백질의 발현 = 26 6. Immunoprecipitation assay = 26 IV. 고찰 = 36 V. 참고문헌 = 40 Abstract-
dc.formatapplication/pdf-
dc.format.extent4727064 bytes-
dc.languagekor-
dc.publisher이화여자대학교 대학원-
dc.title운동단백질인 Human KIF4와 결합하는 세포단백질 확인-
dc.typeMaster's Thesis-
dc.format.pageviii, 45 p.-
dc.identifier.thesisdegreeMaster-
dc.identifier.major대학원 생물과학과-
dc.date.awarded2000. 2-
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일반대학원 > 생명·약학부 > Theses_Master
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