Intracellular-, extracellular- and transmembrane regions involved in oligomerization and functional changes of muscarinic receptors

Abstract

G protein coupled receptors (GPCR) mediate a variety of signaling processes, such as neurotransmission, hormonal response, olfaction, and light transduction. All GPCRs share a common tertiary structure consisting of seven transmembrane (TM I-VII) helices which are connected by an extracellular amino terminus (N) and a cytoplasmic carboxy-terminus (C) and three extracellular (o1-o3) and three intracellular (i1-i3) loops. GPCRs interact with heterotrimeric guanine-nucleotide-binding regulatory proteins (G proteins), which then interact with effector systems and regulate various intracellular processes. Although traditional models predict that GPCRs function as monomers and couple to G protein in a 1: 1 ratio, recent studies suggest GPCRs also form dimeric or oligomeric compelxes. Interactions between GPCRs could involve an association between identical proteins (homomers) or non-identical proteins (heteromers) and between two monomers (to form dimers) or multiple monomers (to form oligomers). GPCR dimeriza tions have shown to occur by the various mechanisms such as disulfide covalent linkage, and/or noncovalent (ionic, hydrophobic) interactions of the N-terminal, transmenbrane (TM) and/or intracellular domains. Muscarinic receptors which are members of GPCR families may also be arranged in dimeric or oligomeric complexes. Muscarinic receptor oligo-merization has been speculated but there are no direct systematic experimental evidences about dimerization mechanism. In this study existences of multimers as well as monomers are confirmed via Western blotting by subtype specific antibodies. Then, whether muscarinic receptors form homomer or heteromer by direct protein-protein interaction within the same or different subtype was examined using yeast two-hybrid system. Each cytoplasmic loop and C-terminal cytoplasmic tail of human muscarinic (Hm) receptor subtypes, Hm1, Hm2 and Hm3, were cloned into the vectors (pB42AD, pLexA) of two-hybrid system and examined direct protein-protein interactions between cytoplasmic domains. No direct protein-protein interactions were observed between intracellular domains of all Hm/Hm receptor sets tested. These results suggest Hm1, Hm2 and Hm3 muscarinic receptors do not interact direct ly through either hydrophilic intracellular domains or C-terminal tail domains to form dimer or oligomer. We further investigated extracellular domain interactions. N-terminus and each extracellular loop were also cloned into the vectors of two-hybrid assay to reveal the interactions of extracellular domains. Because cloning of extracellular domains except Hm2N-terminal (Hm2N) into pLexA was not appropriate for two-hybrid assay, interactions of Hm2N with Hm2N, Hm2o1, Hm2o2, Hm3N, Hm3o1 or Hm3o2 were examined. N-terminal domains of Hm2 also have no direct interaction with any extracellular domain. From our results, the possibility of direct interaction of muscarinic receptor subtypes (Hm1, Hm2 and Hm3) as mechanism for homo- or heteromeric dimerization/oligomerization was excluded. On the other hand, the possibility that interaction may occur indirectly or require proper conformation or subunit formation or hydrophobic region involvement could be raised. It has been postulated that GPCR TM VI is able to be involved in receptor functions as well as dimerization. Therefore, in the present study, it has planned to pursue the role of TM VI in muscarinic receptor ligand binding and other functions as well as receptor dimerization. So far, only the effect of TM VI peptide on m1 muscarinic receptor binding has been tested. Treatment of Sf9 cells expressing Hm1 receptors with increasing concentrations of a peptide derived from TM VI of Hm1 muscarinic receptor produced a reduction of ligand binding activity to the m1 receptor. No effect on binding activity was observed when membranes were incubated with peptide vehicle and control peptide of random sequences with similar size to peptide of Hm1 muscarinic receptor TM VI. The role of TM regions of muscarinic receptors in dimerization and other intracellular functions needs to be investigated in the future studies. Although muscarinic receptor proteins with similar size to multimers as well as monomers were detected via Western blotting in our experimental system, nature of oligomeric protein should be further analyzed via more specific techniques such as immunoprecipitation.;G protein coupled receptor (GPCR)들은 G protein과 coupling을 통해 신경 전달 과정, 내분비계 반응과 빛 전달 등의 다양한 세포 내 신호 전달 과정들을 매개한다. 모든 GPCR은 공통적으로 일곱 개의 transmembrane (TM I -TM VII) 부위가 세포 밖의 아미노 말단, 세포 안의 카르복실 말단, 세 개의 extracellular loop (o1-o3)및 세 개의 intracellular loop (i1-i3)로 연결되어 있다. GPCR들은 각 세포 내에서 monomer로서 G protein과 1:1로 couple 되어 기능을 수행한다고 생각되어져 왔으나 최근 이들이 dimer 또는 oligomer로서 복합체를 형성하여 새로운 기능을 수행할 수 있다는 증거들이 제시되고 있다. GPCR간의 상호 작용은 동일한 단백질 내에서 이뤄져 homomer를 이룰 수 있거나 다른 단백질끼리 heteromer를 만들 수도 있으며, 두 개의 monomer가 조합하여 dimer를 만들기도 하며 두 개 이상의 여러 monomer가 모여 oligomer를 이룰 수 있다. GPCR의 dimerization은 다양한 기전을 통해 생성된다고 여겨진다. 그 예로 disulfides간의 공유결합뿐 아니라 아미노 말단이나TM 부위 사이의 혹은 수용체의 세포 내 부위의 이온성 결합이나 친지질성 비공유결합을 들 수 있다. Muscarinic receptor는 GPCR의 구성원으로서 dimeric 또는 oligomeric 복합체를 형성할 수 있을 것이라 예상되어져 왔다. 그러나 실제로 dimeric 또는 oligomeric 복합체의 존재를 직접적인 물리적 증거로 제시된 바가 적으며 복합체 형성의 기전을 직접적으로 설명된 연구가 없다. 따라서 본 연구에서는 먼저 Western blotting을 통해 muscarinic receptor 단백질의 monomer 뿐 아니라oligomeric 상태를 확인하고 muscarinic receptor가 동일 subtype 간 또는 서로 다른 subtype 간에 직접적으로 상호 작용을 하여 oligomer를 형성하는지를 yeast two-hybrid 체계를 이용하여 조사하였다. Human muscarinic (Hm) receptor subtypes인 Hm1, Hm2과 Hm3 각각의 카르복실 말단과 i1, i2와 i3 부위를 yeast two-hybrid를 위한 vector (pB42AD, pLexA)에 cloning하여 yeast two-hybrid assay를 시행한 결과 세포 내 부위 간의 직접적인 상호 작용은 관찰되지 않았다. Hm2과 Hm3의 세포 밖 부위인 아미노 말단, o1와 o2 도 yeast two-hybrid를 위한 vector에 cloning하여 yeast two-hybrid assay시행하여 세포 밖 부위간의 상호작용을 조사하고자 하였다. Hm2N 과 Hm2N, Hm2o1, Hm2o2, Hm3N, Hm3 o1, Hm3o2 간에 상호작용을 조사한 결과 역시 이 부위에서도 직접적인 상호작용이 관찰되지 않았다. 따라서 본 실험 결과로부터 Hm1, Hm2, Hm3 muscarinic receptor 간의 어느 곳에서도 친수성 부위 간의 직접적인 단백질 상호 작용은 없는 것으로 간주되며 이는 muscarinic receptor 간의 상호 작용이 올바른 conformation, subunit 형성이나 친지질성 부위간의 결합과 같은 간접적인 방식으로 매개될 가능성을 제시한다. 또한 본 연구에서는 친지질성 TM중에서도 다른 GPCR의 기능이나 dimerization에 영향을 끼칠 가능성이 높은 것으로 보고되고 있는 TM VI부위의 muscarinic receptor와의 상호 작용 가능성을 가정하여 Hm1 muscarinic receptor의 TM VI에 해당하는 부위의 peptide를 제조하여 TM VI가 Hm1 muscarinic receptor의 dimerization과 ligand binding 및 기능에 관여되는지를 조사하고자 하였다. Hm1 TM VI peptide가 muscarinic receptor antagonist인 [^3 H]QNB binding에 끼치는 영향을 조사한 결과 Hm1 muscarinic receptor TM VI peptide가 높은 농도일 때 antagonist의m1 muscaric receptor에 대한 binding 능력이 감소된 것을 관찰했다. 앞으로 TM VI가 Hm1 muscarinic receptor의 dimerization/ oligomerization 뿐 아니라 agonist-stimulated phosphatidylinositol hydrolysis와 같은 기능에 어떤 영항을 끼치는지에 대한 연구가 행해져야 할 것이다.