Neplanocin A 유도체의 S-Adenosylhomocysteine hydrolase에 대한 저해 효과와 그 작용 기전에 관한 연구

Abstract

S-adenosylhomocysteine hydrolase는 adenosylhomocysteine을 adenosine과 homocysteine으로 가수분해시키는 효소이다. 이 효소는 대부분의 바이러스가 복제하는데 있어서 공통적으로 필요로 하는 효소로서, viral mRNA의 전사에 필수적인 viral mRNA의 5´-terminal capped methylated structure의 형성에 관여한다. 따라서 이 효소의 저해제는 강력하고 광범위한 항바이러스 작용을 갖는다. 지금까지 개발된 많은 저해제들 중 아데노신 유도체인 neplanocin A가 매우 우수한 저해활성을 나타낸다고 알려져 있다. 그러나 neplanocin A는 효소와 공유결합력이 약하여 온화한 조건에서도 효소의 기능이 다시 돌아오는 가역반응이 일어남이 보고되었다. 본 실험에서는 neplanocin A의 이러한 단점을 보완하고자 합성된 여러 neplanocin A 유도체들의 저해 활성 정도와 그 반응기전을 규명하고자 하였다. 효소의 활성은 adenosine과 homocysteine으로부터 효소의 작용으로 합성되는 adenosylhomocysteine의 양을 측정하여 확인하였으며 효소를 저해제와 반응시킨 후 생성되는 adenosylhomocysteine의 양의 변화로 저해제의 저해활성을 측정하였다. 생성된 adenosylhomocysteine은 HPLC를 이용하여 258 nm에서 분석하였다. Neplanocin A의 cyclopentene ring의 5′위치에 halogen이 치환된 경우, 치환된 halogen의 크기가 작아짐에 따라 저해 효과가 크게 나타났다. Neplanocin A의 hydroxymethyl moiety를 제거한 경우는 저해 효과가 감소하였으며, cyclopentene ring의 double band를 없애고 cyclopropane을 도입한 경우도 저해 효과의 현저한 감소를 보였다. 이와 같은 결과로 미루어 neplanocin A의 구조 중 hydroxymethyl moiety와 cyclopentene ring의 double band가 S-adenosylhomocysteine hydrolase에 대한 neplanocin A의 저해작용에 있어 매우 중요함을 알 수 있었다. 실험에 사용한 저해제 중 neplanocin A의 cyclopentene ring의 5′위치에 F가 치환된 LJ-276(IC_50=0.48 μM)이 가장 큰 효과를 보였다. LJ-276은 SAH hydrolase를 농도와 반응시간에 의존적으로 저해하였으며, 저해 작용은 비가역적이었다. 또한 효소를 저해하는 과정에서 조효소인 NAD+ 중 일부(35.8%)만을 NADH로 환원시켜 대부분(91.7%)을 NADH로 환원시키는 neplanocin A와 차이를 보였다. 효소의 활성을 완전히 저해시키면서도 NAD+의 일부만을 NADH로 환원시키는 것으로 보아 LJ-276은 효소를 저해하는 데 조효소의 환원작용 외 다른 작용 기전을 가지고 있음이 측정된다. ^19F NMR 실험에서 LJ-276이 효소와 반응 할 때 fluoride(F^-)가 유리되었는데 이 결과로 LJ-276이 조효소를 환원시키는 작용 외에 F^-가 유리되면서 효소와 공유결합을 형성하여 효소 활성을 저해하는 기전을 가지고 있음을 확인하였다.;S-adenosylhomocysteine(SAH) hydrolase catalyzes the reversible hydrolysis of adenosylhomocysteine(AdoHcy) to adenosine(Ado) and homocysteine(Hcy). Because of its important role in the regulation of biological methylation reactions, it has attracted attention as a target of antiviral agents. Neplanocin A is the most potent SAH hydrolase inhibitor among the inhibitors known, but its inhibitory activity is reversible. In this study, the inhibitory activities of several analogues of neplanocin A(Group I, Group II, Group III) were assayed against recombinant human placental SAH hydrolase. The activity of the SAH hydrolase was determined by measuring the formation of AdoHcy from Ado and Hcy. AdoHcy was analyzed by HPLC using C_18 reverse-phase column. The peak of AdoHcy was monitored at 258 nm. The inhibitory effects of SAH hydrolase inhibitors depended on the sizes of the halogens substituted at C5' position of cyclopentene ring of neplanocin A and were shown to be in the order of I<Cl<Br<F. Hydroxymethyl moiety of neplanocin A was important part in the inhibition of SAH hydrolase. LJ-276 was the most potent inhibitor among the evaluated inhibitors. Incubation of SAH hydrolase with LJ-276 resulted in concentration and time-dependent inactivation of enzyme. LJ-276 caused partial conversion(35.8%) of the enzyme from its E-NAD^+ to E-NADH form during the inactivation process. Whereas neplanocin A caused almost complete conversion(91.7%). In this result, it was confirmed that inactivation of SAH hydrolase by neplanocin A involves a type I mechanism(cofactor depletion) and LJ-276 had another mechnism except cofactor depletion. LJ-276 released fluoride ion on inactivation of enzyme. This result suggested that LJ-276 inactivated the SAH hydrolase by covalent binding to the enzyme active site.