Study of interactions between inhibitors and their target enzymes by computer -aided molecular docking using FlexDock

Abstract

Dihydrofolare reductase(DHFR) which is an attractive target for antiproliferative drug design because of its important role in the synthesis of DNA was used as a target protein. Prediction of the binding mode of a ligand to its target protein is an important problem in rational drug design. A computer program, FlexiDock with genetic algorithm was used in this study to carry out the molecular docking operation automatically. The program allows for the full flexibility of ligands in the docking calculations, allowing the user to define the flexible bonds during the docking process. This program may be used to predict the precise binding mode of ligands to target proteins to discover novel lead compounds. Original ligands of human, Escherichia coli, Candida albicans DHFR-NADP+(NADPH)-ligand ternary complexes were docked into the protein active sites and the energy of the protein-ligand complexes were calculated. The results agree well with the X-ray complex structures with very small rms deviations. Four known ligands were also docked into human DHFR-NADP+ binary complex. Docking searches demonstrated that these ligands were docked well into the active site of the enzyme. N4-(2-Acetoxyethoxymethyl)-2-acetylpyridine thiosemicarbazone(AATSC) has been reported to have inhibitory activity against bovine DHFR. In this experiment, three thiosemicarbazone derivatives including AATSC were docked into DHFR of three different species using FlexiDock. The ligands were docked into DHFR free enzyme, DHFR-NADP+(NADPH) binary complex, and DHFR-inhibitor binary complex to find out the exact location where the ligands bind to the enzyme. As the results, all three derivatives were docked sucessfully into DHFRs with different binding spaces implying that the ligands can either bind to the coenzyme site or substrate site. The results also show that each ligand has different binding modes to the enzymes of the same species and demonstrates that the same ligand has specific binding modes to the enzymes of different species. Resistance to antibiotics has been increasing and one of the most common forms of bacterial resistance to the β-lactam antibiotics comes from β-lactamases that hydrolyze β-lacam antibiotics. In recent years bacterial resistance to third generation cephalosporins has increased rapidly because of expression of class C β-lactamases. The β-lactamase inhibitors used clinically at present are ineffective against class C β-lactamases and producing of specific inhibitors against to class C β-lactamases are needed. Tazobactam and three cephalosporin sulfones which were experimentally evaluated as β-lactamase inhibitors were docked to class C Enterobacter cloacae P99 and class A Escherichia coli TEM-1 lactamases using FlexiDock. Tazobactam and C11B docked into E. coli TEM-1 have resulted to have lower energy and more interactions than in case E. cloacae P99. C11C, which had been proved to be a good inhibitor of E. cloacae P99 β-lactamase, was resulted to form low energy conformations with the enzyme. On the other hand, C11D, which has low inhibitory potency against β-lactamases from the two species, has positioned outside active site area and showed high energy level.;Dihydrofolate reductase(DHFR)은 dihydrofolate를 tetrahydrofolate로 환원하는 과정에 관여하는 enzyme으로 DHFR에 대한 저해는 곧 DNA합성을 저해하여 세포 사멸을 초래한다. 따라서 특정species의 DHFR에 유효한 저해제는 항암제, 항생제, 항진균제 등으로 개발될 수 있다. 한편 Sybyl package의 한 module인 FlexiDock은 genetic algorithm에 근거하여 개발된 docking program으로 protein과 inhibitor에서 flexible bonds를 지정함으로써 induced-fit docking을 수행할 수 있다. 본 연구에서는X-ray crystallography로 구조가 밝혀진 human, Escherichia coli 및 Candida albicans의 DHFR-NADP+(NADPH)-ligand ternary complexes를 Protein Data Bank(PDB)로부터 얻고 original ligand를 extract하여 DHFR-NADP+ (NADPH) binary complex를 얻은 후 여기에extract한original ligand를 FlexiDock을 사용하여 docking하였다. 그 결과 ligand의RMSD가 human, E. coli, 및 C. albicans DHFR각각에서 1.40, 1.57, 및 1.14Å으로 모두2.0Å이하로 나타나 X-ray crystal과 같은 position과 orientation으로 결합하여interaction하는 것을 알 수 있었고 이로써 FlexiDock docking protocol에 의해 X-ray crystal 구조가 재현되는 것을 확인하였다. 다음으로 human DHFR을 target enzyme으로 하여 잘 알려진DHFR inhibitor인 methotrexate, folate, piritrexim, 및 trimethoprim을 docking하였다. 그 결과 original ligand MOT와 구조적 유사성이 있는methotrexate와 folate 및 piritrexim이human DHFR active site에 안정하게 결합하여 MOT와 유사한 interaction을 하는 것을 확인하였고 human DHFR에 대해 inhibitory activity가 낮다고 실험적으로 증명된trimethoprim의 경우 human DHFR에 비교적 높은 energy와 약한interaction으로 결합하는 것을 발견하여 trimethoprim이 human DHFR에 대해 activity가 낮다는 실험적 결과를 뒷받침할 수 있었다. 마지막으로 microorganisms의 성장을 억제하고 bovine DHFR에 대한 저해작용이 있다고 보고된 바 있는thiosemicarbazone 유도체들을 human, E. coli, 및C. albicans의 DHFR-NADP+(NADPH), DHFR free enzyme 및 DHFR-original ligand complex에 docking하여 thiosemicarbazone 유도체들의 세가지 종의 DHFRs에 대한 binding position과 interactions를 조사하였다. 그 결과 docking에 사용한 세가지 thiosemicarbazone 유도체들은 모두 DHFR-NADP+(NADPH) binary complex의 substrate site에 안정하게 결합됨을 알 수 있었으나 RMSD와 energy값, 그리고 interaction의 내용에서는 어느 정도의 차이를 나타내었다. 이 유도체들을 DHFR free enzyme에 docking하였을 때에는 ligand에 따라, 그리고 DHFR species에 따라 substrate site에 결합하거나 또는 substrate site와 NADP+(NADPH) site에 걸쳐서 docking됨으로써 species에 따른 구조적 차이에 기인한 interaction의 차이를 나타내었으며 DHFR-ligand binary complex에 docking하였을 때에는 한 가지 경우를 제외하고는 모두 NADP+(NADPH)의 nicotinamide site에 결합하였다. 이상의 결과로부터 이 유도체들은 substrate site뿐 아니라 coenzyme site에도 결합할 수 있는 구조를 가졌음을 알 수 있었고 이로부터 uncompetitive inhibition kinetics를 나타낸다는 실험결과를 뒷받침할 수 있었다. Bacteria는 β-lactamase를 생성하여 β-lactam antibiotics에 대한 resistance를 획득하였고 이에 대응하여 β-lactamase inhibitor를 β-lactam 항생제와 함께 사용함으로써 β-lactamase에 대한 항생제의 파괴를 줄일 수 있었다. 그러나 bacteria는 여기에 적응하여 새로운 형태의 β-lactamase를 만들어내므로 지속적인 β-lactamase inhibitor의 개발이 요구되며 특히 제3세대 cephalosporins에 대해 resistance를 부여하는 class C specific한 β-lactamase inhibitor의 개발이 시급한 실정이다. 본 연구에서는X-ray crystallography로 구조가 밝혀진 class C Enterobacter cloacae P99와 class A Escherichia coli TEM-1 β-lactamase structures를 Protein Data Bank(PDB)로부터 얻은 후 각 구조에서original ligand를 extract하고 이를 다시FlexiDock을 사용하여 original enzyme에 docking하였다. 그 결과 original ligand의 RMSD가 각각 1.99, 0.90Å으로 나타나 본래의 position과 orientation으로 β-lactamase structure에 결합하여 X-ray crystal 구조에서와 같은 interaction을 하는 것을 확인하였고 이로써FlexiDock docking protocol에 의한reproducibility가 우수하다는 것을 알 수 있었다. 또한 도입하는 치환기에 따라 class C E. cloacae P99나 class A E. coli TEM-1 β-lactamase에 더 유효한 저해작용을 갖는다고 보고된 cephalosporin sulfone 유도체들과 tazobactam을 두 종의 β-lactamase structures에docking하였다. 그 결과 E. cloacae P99 β-lactamase에 대해IC50값이 좋은 C11C가 낮은 energy와 다수의 수소결합으로 E. cloacae P99 β-lactamase의 active site에 결합하였고 E. coli TEM-1 β-lactamase에 대해서는 IC50 값이 두번째로 좋은 C11B가 가장 낮은 energy와 다수의 interaction으로 E. coli TEM-1 β-lactamase의 active site에 결합하였다. 반면에 두 종의 β-lactamases에 대해IC50값이 좋지 않은 C11D는 두 종 모두에서 SER 잔기에서 멀어져 SER과 covalent bonding을 할 확률이 극히 적고 β-lactamase 잔기와의interaction이 적으며 energy도 높게 나타나 β-lactamase에 대한 activity가 낮음을 알 수 있었다.