Peroxisome proliferator-activated receptor-r의 ligand인 15-deoxy-Δ12,14-prostaglandin J2가 neuroblastoma cells에서 세포사멸을 통한 세포 성장억제 유도 및 기전 연구

Abstract

Peroxisome Proliferator-activated receptors (PPARs)는 nuclear hormone receptor super-familiy ligand-dependent transcription factor로 3개의 subtypes (PPAR-α, β, γ) 을 가지고 있다. 이들은 지질대사나 지방형성(adipogenesis), 인슐린 감작(insulin sensitization)을 조절하는 것으로 알려지고 있다. 최근 PPARs은 세포분열, 분화, 세포사멸에 연관된 다양한 연구가 되고 있으나 아직 그 기전이 명확하게 밝혀지고 있지 않은 실정이다. 이중 PPAR-γ는 암 세포들에서 어떤 특별한 작용메카니즘을 통해 세포의 성장을 억제한다는 보고가 되고있다. 15-deoxy-Δ^12,14-prostaglandin J₂ (15d-PGJ₂)는 PPAR-γ의 agonists로 지방세포(adipicyte)의 분화를 유도하는 물질로 잘 알려지고 있으며 최근 유방, 전립선, 신장, 결장, 최장, 폐 등의 암 세포들에서 PPAR-γ를 활성화를 통하여 세포사멸(apoptosis)을 유도하는 물질로 보고되고 있다. 15d-PGJ₂에 의해 최근 사람 neuroblastoma cell line인 LA-N-5 cell에서 PPAR-γ가 발현되었고 PPAR-γ의 활성은 세포분화를 유도한다고 보고되었다. 따라서 본 실험에서는 neuroblastoma cell line인 SK-N-SH와 SK-N-MC에서도 15d-PGJ₂가 PPAR-γ를 활성화시키고 세포사멸을 유도하는지를 실험하였다. 먼저 본 실험에서는 15d-PGJ₂가 neuroblastoma cells에서 PPAR-γ의 발현을 보았더니 SK-N-SH와 SK-N-MC cells 모두에서 농도 의존적으로 PPAR-γ가 증가 발현되었고 24시간까지는 발현이 증가하다가 그 이후에는 감소하는 경향을 보였다. 또한 이를 면역염색을 하였더니 처리하지 않은 세포에서는 peri-nucleaic 부분이나 세포질에 존재하다가 15d-PGJ₂가 처리된 cell에서는 PPAR-γ가 핵 안으로 전위(translocation)됨을 볼 수 있었다. 다음으로 15d-PGJ₂에 따른 neuroblastoma cell의 세포 형태학적 변화를 보았더니 SK-N-SH와 SK-N-MC cells 모두에서 15d-PGJ₂의 농도, 시간 의존적으로 세포가 사멸되는 것을 볼 수 있었고, neurite outgrowth가 형성됨을 관찰 할 수 있었다. 이는 15d-PGJ₂가 neuroblastoma cells에서 세포사멸 뿐 아니라 세포형태학적 분화를 유도한다는 것을 알 수 있다. 또한 세포성장억제를 확인하기 위해서 세포 수와 MTT assay를 하였더니 역시 농도, 시간 의존적으로 세포의 생존력이 현저하게 감소함을 볼 수 있었다. 그러면 PPAR-γ agonist인 15d-PGJ₂에 의한 세포성장억제가 세포주기와 어떤 관련이 있는지를 알아보기 위해 flow cytometer를 통하여 세포주기를 측정하였다. 이에 SK-N-SH와 SK-N-MC cells에서 모두 15d-PGJ₂ 고농도로 갈수록 sub-G0 phase (apoptotic pick) 가 증가하고 G0/G1 phase가 감소하며 G2/M phase가 현저하게 증가함을 보였다. 이를 확인하기 위해 세포주기 관련 단백질들의 발현을 western blot analysis를 통하여 보았다. 결과 cdk4, cyclin D1, cdk2, cyclin A, cyclin E, cdc25C는 감소 발현되고 G2/M phase에 관여하는 cyclin B1은 농도 의존적으로 현저하게 증가 발현됨을 관찰 할 수 있었다. 또한 세포사멸(apoptosis)을 확인하기 위하여 DAPI staining을 하였더니 15d-PGJ₂를 처리한 세포에서 농도 의존적으로 세포사멸체(apoptotic body)가 많아지는 것이 관찰되었고 세포사멸 관련 유전자인 caspase 3, 9, pro-apoptotic Bax는 활성화되었고, anti-apoptotic Bcl-2는 감소 발현됨으로 확인 할 수 있었다. 대부분의 세포사멸 관련 메카니즘은 MAP kinase 경로와 연관되어 있다고 알려지고 있다. 본 논문에서도 15d-PGJ₂에 의해 유도된 세포사멸과 관련된 MAP kinase 경로를 알아보기 위하여 MAP kinase인 ERK, JNK, p38의 발현을 western blot analysis를 통하여 알아보았다. total MAP kinase의 발현에는 큰 변화가 없었으나 인산화된 ERK가 크게 활성됨이 관찰되었고 또한 ERK inhibitor인 PD98059를 15d-PGJ₂와 병용처리 하였더니 인산화된 ERK가 현저하게 감소하고, PPAR-γ, caspase 3, cyclin B1의 발현이 감소하였다. 그리고 세포형태학적 분화(morphological-dfferentiation)도 억제하였다. 마지막으로 15d-PGJ₂에 따른 NF-κB와 AP-1의 활성을 관찰하였더니 3시간까지는 활성이 증가되었다가 그 이후의 시간부터는 감소하는 것이 관찰되었다. 지금까지의 결과들에 따르면 PPAR-γ의 ligands인 15d-PGJ₂는 사람 neuroblastoma cell line인 SK-N-SH와 SK-N-MC cell에서 PPAR-γ의 활성이 세포사멸을 통한 세포성장을 억제함을 확인하였다. 더 나아가 15d-PGJ₂는 SK-N-SH와 SK-N-MC cells에서 neurite outgrowth를 형성하는 것으로 보아 세포분화를 촉진하는 물질로 사료된다. 또한 NF-κB와 AP-1의 활성을 억제하는 물질로 추측된다. 이런 결과를 종합하여 볼 때 PPAR-γ의 ligands인 15d-PGJ₂는 human neuroblastoma cell line인 SK-N-SH와 SK-N-MC cell에서 암 치료에 중요한 후보 물질로 사료된다.;Peroxisome proliferator-activated receptors (PPARs) are member of the nuclear hormone receptors superfamily of ligands-dependent transcriptional factors. Three major subtypes have been discribed (PPAR-α, β and γ), and they are involved with the control of lipid metabolism, adipogenesis, and insulin sensitization. More recently they have been linked to the processes of cellular proliferation, differentiaton, and apoptosis by complex and incompletely understood mechanisms. Recent investigations have demonstrated that activation of PPAR-γ lead to growth inhibition of cancer cells by specific mechanisms. 15-deoxy-Δ^12,14-prostaglandin J₂ (15d-PGJ₂), a peroxisome proliferator activated receptors (PPAR-γ) ligand, has been shown to stimulate adipocyte and tumor cell differentiation. It was also found that 15d-PGJ₂ inhibited cell growth through activated PPAR-γ and induced apoptosis of several cancer cells including breast, prostate, kidney, colonic, renal pancreatic, and lung cancer cells. In addition, a very r ecent study demonstrated that PPAR-γ was expressed in human neuroblastoma cell LA-N-5 cells and PPAR-γ signaling pathway is involved in the regulation of neuroblastoma cell growth and differentiation. In the present study we have demonstrated that two common human neuroblastoma cell lines SK-N-SH and SK-N-MC expressed PPAR-γ. 15d-PGJ₂ can stimulate the differnetiation and decreased cell number and cell viability in a time- and dose-dependent manner. Flow cytometric analysis showed that these cell were arrested in G2/M phase after 15d-PGJ₂ treatment. Forthermore, 15d-PGJ₂ significantly increased the expression of cyclin B1 but decreased the expression of cdk4, cyclinD1, cdk2, cyclin A, cyclin E, and cdc25C. We also found that 15d-PGJ₂ induced apoptosis in these cells in a dose dependent manner. Consistent with the inducton of apoptosis, 15d-PGJ₂ increased caspase 3, caspase 9, and pro-apoptotic Bax but down-regulated anti-apoptotic Bcl-2. We also show that MAP kinase pathway. 15d-PGJ₂ activates ERK MAP kinase but not JNK and p38. ERK MAP kinase inhibitor PD98,059 decreased 15d-PGJ₂-induced activation of phosphorlyated ERK, expression of PPAR-γ, and expression of cyclin B1. Finally, ERK MAP kinase inhibitor PD98,059 significantly protected against 15d-PGJ₂-induced apoptosis by increasing ERK MAP kinase phosphorlyation. Moreover we found that 15d-PGJ₂ inhibited activation of AP-1 and NF-κB. Taken together, these results suggest that 15d-PGJ₂ may be a candidate agents to use as a therapeutic agent for neuroblastoma.