지방조직 유래 중간엽줄기세포에 의한 HL-60세포의 활성 및 생존 향상

Abstract

연구 배경: 항암치료과정에서 발생하는 호중구감소증은 과립구집락자극인자 (granulocyte colony-stimulating factor, G-CSF)가 도움이 되기는 하지만 아직도 치명적인 결과를 초래하는 가장 중요한 합병증이다. 이에 본 연구는 지방조직 유래 중간엽줄기세포(adipose tissue derived Mesenchymal stem cell)가 장기재생 및 면역조절능력 이외에 호중구의 생존 및 기능을 촉진시킬 수 있는지 알아보고자 하였다. 방법: 호중구는 HL-60 세포주 (ATCC No. CCL-240) 를 0.8% N, N-Dimethylmethanamide (DMF)로 분화시킨 후 이용하였고 지방조직 유래 중간엽줄기세포는 사람의 지방 조직에서 만든 세포주(RNLbio)를 이용하였다. 다양한 농도의 혈청 배지에 지방조직 유래 중간엽줄기세포와 호중구를 함께 배양하여 지방조직 유래 중간엽줄기세포가 호중구의 활성에 미치는 영향을 활성산소 배출법(Respiratory burst)으로 확인하였다. Annexin V와 PI염색을 통한 유세포분석으로 세포사멸을 측정하여 호중구의 생존을 확인하였고, 3-(4,5-dimethylthizol-2-yl)2,5-diphenyl tetrazolium bromide assay (MTT assay)로 호중구의 증식을 확인하였다. 한편, 호중구의 대표적인 성장 인자인 G-CSF와 과립구 큰포식세포 집락자극인자(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF), interferon α (IFN-α), interferon β (IFN-β), transforming growth factor β (TGF-β)가 중간엽줄기세포에서 분비되는 것을 알아보기 위해 RNA와 세포 배양액을 얻어 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR)을 시행하였다. 결과: 지방조직 유래 중간엽줄기세포 첨가에 의해 호중구의 활성이 증가하였고, 혈청 제거에 의해 유발된 호중구 사멸을 회복시켰다. MTT assay에 의한 증식 측정에서 지방조직 유래 중간엽줄기세포의 첨가 군에서 정상 배지에서 배양한 기준 값으로 회복되는 것을 확인하였다. 지방조직 유래 중간엽줄기세포의 RNA 및 세포 배양액에서 IFN-α, TGF-β, G-CSF가 증가함을 확인하였다. 결론: 지방조직 유래 중간엽줄기세포는 호중구의 기능을 활성화시키고 생존을 향상시키는데, 중간엽줄기세포에서 IFN-α, TGF-β, G-CSF를 분비하는 것이 그 기전 중의 하나일 것으로 생각된다.;Background and Objectives: Neutropenia is a frequent complication of anticancer chemotherapy often associated with life-threatening infections, hospitalization, dose reduction and/or delay in the administration of chemotherapy although administration of recombinant granulocyte colony-stimulating factor reduces the duration and the degree of chemotherapy induced neutropenia. So we investigated the ability of adipose tissue derived stem cells to promote survival and function of neutrophils other than differentiation into multi-lineages and immunomodulatory function. Materials and Methods: We used HL-60 (ATCC No. CCL-240 Human promyelocytic leukemia cells) differentiated into neutrophils by 0.8% N, N-Dimethylmethanamide (DMF). And human Mesenchymal stem cells derived from adipose tissue (ad-MSC) were provided by RNL bio. We set up a coculture system of ad-MSCs and neutrophils so that we could analyze the effect of ad-MSC to the viability, survival and proliferation of neutrophil. And we investigated various soluble factors (granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF), granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), interferon α, interferon β, transforming growth factor β (TGF-β)) that ad-MSC secrete and stimulate neutrophils by ELISA and RT-PCR. Results: When neutrophils were cocultured with Ad-MSCs, activated neutrophils showed increased respiratory burst ability, decreased apoptosis, and increased proliferation by MTT assay. And cocultured media showed increased concentration of interferon α, TGF-β, and G-CSF than ad-MSC alone did. Conclusions: Ad-MSC secreted large amount of interferon α, TGF-β, and G-CSF, so that promoted the viability, survival and proliferation of neutrophils.