Quantitative PCR을 이용한 인체 폐 섬유아세포 P53 gene에서의 국소적 DNA 손상 분석

Abstract

Cellular DNA is continuously attacked by various factors including abasic sites, alkyl lesions, UV-induced thyrimidine dimers. Even with all of the cellular DNA repair systems available, some DNA adducts are present in cells and lead to misincorporation, mutation, DNA replication interruption. Consequently, DNA damage can cause cell death, aging, and cancer. To measure DNA damage, a variety of detection methods such as HPLC, southern blotting, real-time PCR and quantitative PCR(QPCR) have been used. DNA damage has been suggested to be associated with many diseases such as cancer and cardiovascular diseases from many studies. DNA damage has been analyzed at the level of total DNA and the gene. However the regional differences of DNA damage in one gene have not been determined yet. This study analyzed the formation of regional DNA damage in the P53 gene of MRC-5 cells after exposure to DNA damage agents, through QPCR methodology. Hifi hotstart polymerase (KAPA, Massachusetts, USA) was utilized for QPCR, because it is the newly engineered B-family polymerase showing very high processivity and fidelity. The whole sequence of P53 gene was divided into 7 segments to amplify by QPCR and the segment of housekeeping gene β-actin was used for control. Three different chemicals (MMS, cisplatin and H2O2) were to Human lung fibroblast MRC-5 cells and the extracted genomic DNA were used as templates in QPCR. PCR products were quantitated by densitometric analysis and the DNA lesion frequency in the gene fragment were estimated using the equation S= -ln AD/A0 (A0: band density from non-treated control DNA, AD: band density from treated DNA). DNA lesion frequencies of all the segments for P53 and beta-actin genes were increased in proportion to the doses of treated MMS or cisplatin, but were not significantly changed with treatment of hydrogen peroxide in cells, when determined by Hifi-used QPCR. After exposure to the methylating agent MMS, all the segments of P53 gene except for the 1st segment(containing exon 1) were about 2-3fold more highly damaged than the control beta-actin gene segment. Among them, MMS-induced DNA damage was the most prominent in the 7th segment containing exons 11 and 12, the 5th P53 gene segment containing exons from 5 to 8 (DNA binding domain), and the 4th segment containing exons from 2 to 4. The cross-linking agent cisplatin also induced high DNA damage but the amount of DNA damage in all the segments of P53 gene was similar to that in the control beta-actin gene segment. However, the Hifi used QPCR assay was not able to detect DNA damage by the oxidative agent hydrogen peroxide. Hifi and taq bypassed 8-oxoguanine well but pfu stalled at that lesion in the primer extension experiment, indicating that pfu might be an adequate PCR enzyme alternative to detect oxidative damage. In this present study, we demonstrated that the Hifi-using QPCR method are applicable to detect the methylated and cross-linked DNA damage but not oxidative DNA damage at the sub-gene level of P53 gene. Our results also suggest that the methylating agent might cause the preferential DNA damage in specific regions (e.g. DNA-binding domain) of P53 gene, and leading to disruption of its tumor-suppressive transcription factor function of the resulting P53 protein in alkylation-damaged cells.;세포 내 DNA는 여러 가지의 요인들에 의해 계속해서 공격을 받는다. abasic site 형성, 염기의 alkylation, 자외선으로 인한 thyrimidin dimer 형성 등에 의해 DNA손상을 일으킬 수 있다. 세포 내 DNA 수복 시스템이 유효하여도, 세포 내 남아있는 몇몇의 DNA adduct들은 잘못된 염기삽입(misincorporation), 돌연변이를 유발하거나 DNA복제를 중지시키며, 그 결과 DNA 손상은 세포 사멸(cell death), 노화 및 종양을 일으킬 수 있다. DNA 손상을 측정하기 위해 HPLC, southern blotting, real-time PCR, quantitative PCR(QPCR)과 같은 다양한 방법들이 사용되어 왔다. DNA 손상은 암, 심혈관 질환과 같은 많은 질병과 관련이 있음이 많은 연구에서 알려져 있다. DNA 손상은 total DNA와 gene 수준에서 분석되어왔다. 그러나 한 gene에서의 DNA 손상의 국소적인 차이는 아직 알아내지 못했다. 본 연구에서는 유전자 손상 물질 처리 후 세포내의 P53 gene에서 DNA damage 형성을 QPCR을 이용하여 알아보고자 하였다. QPCR에 이용한 Hifi hotstart polymerase(KAPA, Massachusetts, USA)는 새롭게 제작된 B-family polymerase 로 높은 진행도와 정확도를 보인다. P53 gene의 전체 sequence를 7개의 segment로 나누고, housekeeping gene인 β-actin의 segment를 control과 유전자 손상물질 methyl methanesulfonate (MMS), cis-diammineplatinum(II) dichloride(cisplatin), hydrogen peroxide (H2O2)를 인체 폐 섬유아세포(MRC-5)에 처리하여 세포에서 추출한 DNA를 QPCR에 이용하였다. PCR product는 band density를 분석하고 각 gene fragment의 DNA lesion frequency를 equation S= -ln AD/A0(A0: 비처리군 band density, AD: 처리군 band density)를 이용하여 분석하였다. MMS와 cisplatin을 처리군에서 P53과 β-actin(ACTB) gene의 모든 segment에서 농도에 비례하는 DNA lesion frequency를 볼 수 있었으나, H2O2의 경우 HiFi polymerase를 이용한 QPCR에서 알려진 실험들과 달리 차이를 보이지 않았다. 메틸화 손상을 일으키는 MMS를 노출하였을 때, 1번째 segment(exon1 포함)을 제외하고 모든 segment에서 control ACTB segment와 비교하여 2-3배 높은 손상을 확인하였고, 그 중 exon 10, 11을 포함하는 7번째 segment와 exon 5, 6, 7, 8 (DNA-binding domain)을 포함하는 5번째 segment 및 exon 2, 3, 4를 포함하는 4번째 segment에서 가장 눈에 띄는 손상을 볼 수 있었다. Cross-link를 일으키는 cisplatin 또한 많은 손상을 보였지만 p53 gene segment뿐만 아니라 control ACTB gene segment도 비슷한 손상을 보였다. 그러나 Hifi polymerase를 사용한 QPCR에서 oxidative agent인 H2O2에 의한 손상을 관찰 할 수 없었다. Primer extension 실험에서 Hifi polymerase와 Taq polymerase가 8-oxo-guanine을 잘 통과 합성하지만 Pfu는 중단됨을 볼 수 있었는데, Pfu는 oxidative 손상을 알아낼 적절한 PCR enzyme이 될 수 있음을 나타낸다. 본 연구에서 우리는 Hifi polymerase를 이용한 QPCR에서 p53 의 국소적 gene이 oxidative 손상은 아니지만, 메틸화 손상과 cross-link 손상을 잘 감지하는 것을 보였다. 본 실험에서 메틸화 손상물질이 p53 gene의 DNA-binding 도메인과 같은 특정 부분에서 손상이 일어나는 것을 확인한 결과 세포 내 alkylation 손상이 p53 단백질의 암 억제전사 기능을 방해할 수도 있을 것이라 예상한다.