방선균 이종숙주에 의한 사이클로스포린 A의 선택적 수산화 반응의 효율성 향상 및 유도체 생산

Abstract

사이클로스포린 A는 대표적인 면역억제제로 Tolypocladium inflatum라는 곰팡이에 의해 생산되며, 장기이식 후에 따르는 조직이식 거부반응을 억제하기 위해 사용된다. 사이클로스포린 A는 강력한 면역억제 기능을 가지고 있으나 부작용으로 모발성장을 촉진시킨다. 특히 4-(γ-hydroxy)-CyA 유도체의 경우에 면역 억제 기능은 감소하였으나 모발 성장을 촉진시키는 기능은 강화된 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 사이클로스포린 A의 생물전환 능력을 가진 다양한 미생물 가운데 희소 방선균인 Sebekia benihana를 이용하여 4번 위치가 수산화된 유도체인 4-(γ-hydroxy)-CyA의 생산성을 향상시켰다. 이를 위하여 수산화 유전자가 발현된 재조합 균주와 수산화 유전자 및 전자전이 유전자가 발현된 S. benihana 재조합 균주를 조합생합성을 통해 제작하였으며, 이들 중 Escherichia coli 유래의 flavodoxin과 ferredoxin (flavodoxin) reductase 유전자가 발현된 재조합 균주 (YJ409)를 고체 배양할 경우, 사이클로스포린 A의 4번 위치를 수산화시키는데 가장 효율적이라는 것을 확인하였다. 뿐만 아니라 생장 속도가 빠르고 형질전환의 효율성이 높아 이종숙주로 널리 이용되고 있는 Streptomyces venezuelae (DHS2001)를 통해 사이클로스포린 A의 신규 유도체인 6-(γ-hydroxy)-CyA의 생산이 가능함을 최초로 확인하였다. S. venezuelae에 의해 생전환된 6-(γ-hydroxy)-CyA는 HPLC-ESI-MS/MS 분석을 통하여 정확한 질량 값을 측정하였고, 단편화 양상을 분석함으로써 구조를 예측하였다. 이를 통해 유용한 생리활성물질의 생산성 향상뿐만 아니라 신규 생리활성물질의 개발 가능성을 기대할 수 있다.;The cyclic peptide cyclosporin A (CyA), isolated from the fungus Tolypocladium inflatum and found to possess potent immunosuppressive activity, has been used to remove immune rejection response after tissue transplantation. It is usually expressed as a strong immunosuppression agent but this function was decreased when it was hydroxylated at position 4 of methyl leucine. However in this case it was observed to induce hair growth. In this study, the hydroxylation of position 4 on antibiotic molecule cyclosporin A and enhancement of 4-(γ-hydroxy)-CyA derivative using the rare actinomycetes Sebekia benihana were carried out. Particularly, hydroxylation gene alone and along with electro-transfer gene were expressed in recombinant strain that constructed by combinatorial biosynthesis. Among them, one recombinant strain (YJ409), inserted with Escherichia coli derived flavodoxin and ferredoxin genes, was observed to produce the highest hydroxylated cyclosporin A derivative on the solid medium. In additional, Streptomyces venezuelae (DHS2001), a heterologous expression strain known as fast growth and highest transformation efficiency among actinomycete, was used as host to test the production of 6-(γ-hydroxy)-CyA. This investigation was the first report on the hydroxylation of cyclosporin A. The target compound was analysis by HPLC-ESI-MS/MS of fragmentation pattern. From this work we can produce a physiological active compound as well as it can be used as a new bioactive agent development.