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Chronic behavioral stress induces depression-like behavior and aggravates the pathogenesis of Alzheimer's disease through the mechanism of ROS generation and mitochondria dysfunction in mice

Title
Chronic behavioral stress induces depression-like behavior and aggravates the pathogenesis of Alzheimer's disease through the mechanism of ROS generation and mitochondria dysfunction in mice
Authors
서지선
Issue Date
2011
Department/Major
대학원 뇌·인지과학과
Publisher
이화여자대학교 대학원
Degree
Doctor
Advisors
한평림
Abstract
Physical and psychological stress not only enhances the activity of the hypothalomo-pituitary-adrenocortical (HPA) axis, but also leads to depression-like pathology. It has been suggested that behavioral stress causes oxidative stress by inducing an imbalance between the pro-oxidant and antioxidant status in vivo. However, the mechanisms by which stress promotes depression and adrenal steroid stress hormones generate oxidative stress have not been clearly elucidated. Therefore, the first part of the present study was attempted to dissect the mechanism underlying the stress-induced changes in emotional behavior and to prove any direct roles of glucocoritocoids in induction of oxidative stress in the brain using a depression mouse model with a well-defined behavioral manipulation paradigm and in vitro cell culture system. It was demonstrated that mice treated with restraint for 2 h daily for 14 consecutive days (termed 2h-14d stress) showed long-lasting changes in depression- and anxiety-related behavior. To complement our assertion that the long-lasting changes in depression and anxiety-related behavior are relevant to the symptoms of stress-induced depression and anxiety in human, the anti-depressant imipramine was treated in stressed mice for 15-19 days from the time after the 2h-14d stress. Such administration of imipramine completely reversed stress-induced behavioral changes of animals in depression- and anxiety-related behavior. Biochemical analysis on the ROS production levels revealed that the 2h-14d behavioral stress markedly increased oxidative stress in the brain and the increase of oxidative stress occurred in a stress-time and stress-dose (repetition) dependent manner in the brain. Analysis of ROS production, which was completely blocked by the NADPH oxidase inhibitor, apocynin. These results support the notion that NADPH oxidase activity is critical for corticosterone-induced ROS production. Real-time PCR analysis revealed that among the wide range of genes involved in ROS regulation, the key subunits of NADPH oxidase, p47phox and p67phox, were up-regulated in a conrticosterone-dependent manner. In SH-SY5Y cells transfected with p47phox-siRNA, DCF-reactive ROS generation and DHE-reactive superoxide production, which were induced by corticosterone in normal SH-SY5Y cells, were completely suppressed in a manner of p47phox-siRNA doses. Collectively, these findings implicate that oxidative stress is a major pathological mechanism in chronic stress and stress-induced depression-like behavior. Thus, the results of the present study support the notion that stress hormones have a causal role in generating oxidative stress during the adaptive and chronic responses to stress and in stress-induced depression. This study may hold many important implications for pharmacological interventions targeting cellular oxidants and antioxidants as a promising strategy for protecting against oxidative insults in various psychiatric disorders, including depression, particularly those induced or triggered by physical or psychological chronic stress. Basic and clinical studies have reported that behavioral stress worsens the pathology of Alzheimer’s disease (AD). Recent structural and functional studies of mitochondria have revealed that abnormalities in mitochondria may lead to mitochondrial dysfunction in aged individuals and those with neurodegenerative diseases, including AD. Molecular, cellular, and biochemical studies of animal models of aging and AD have provided compelling evidence that mitochondria are involved in AD development and progression. Further, a role for mitochondrial dysfunction in AD is supported by studies of neurons from autopsy specimens of patients with AD, transgenic AD mice, and neuronal cells expressing human AD mutation, which have revealed that amyloid beta (Abeta) enters mitochondria early in the disease process, disrupts the electron-transport chain, generates ROS, and inhibits the production of cellular ATP, which in turn prevents neurons from functioning normally. However, the underlying mechanism has not been clearly understood. The second part of the present study was devoted to, explore the mechanism how behavioral stress affects AD pathogenesis using Tg-APPswe/PS1dE9 mice, a murine model of AD. Tg-APPswe/PS1dE9 mice treated with restraints for daily 2 h for consecutive 16 days (2h-16d stress) from 6.5 months of age showed significantly increased Abeta(1-42) levels and plaque deposition in the brain. The 2h-16d stress increased oxidative stress and induced mitochondrial dysfunction in the brain. Treatment of glucocorticoid (corticosterone) and Abeta in SH-SY5Y cells additively increased the abeta-binding alcohol dehydrogenase/17beta-hydroxysteroid dehydrogenase type 10 (ABAD/HSD10) expression, mitochondrial dysfunction, and ROS levels. While the blockade of ABAD expression by shRNA-ABAD in SH-SY5Y cells suppressed glucocorticoid-enhanced mitochondrial dysfunction and ROS accumulation. Consistently, the 2h-16d stress up-regulated ABAD expression in the mitochondria in the brain of Tg-APPswe/PS1dE9 mice. Moreover, all identifiable A plaques were co-stained with anti-ABAD in the brain. Together, these results suggest that behavioral stress aggravates the plaque pathology and mitochondrial dysfunction via up-regulation of ABAD in the brain of AD mouse model.;물리적 또는 심리적 스트레스는 시상하부-뇌하수체-부신피질 축(hypothalomo-pituitary-adrenocortical (HPA) axis)을 활성화시키며, 활성화된 HPA axis의한 스트레스 호르몬의 증가로 우울증 행동 반응을 나타낸다. 이러한 스트레스 호르몬의 생체 반응들은 신경계 내에 항산화인자와 산화인자들 조절의 불균형을 초래하여 활성산소 증가를 유발하는 것으로 보인다. 부신스테로이드 스트레스 호르몬의 작용에 의한 활성산소의 생성이 알려져 있으며, 따라서 스트레스로 기인한 우울증의 기전에 이러한 과정에 관여할 것으로 보이나 구체적인 분자적 기전은 알려져 있지 않다. 이에 본 연구는 우울증 동물 모델을 이용하여 우울증 행동 반응과 글루코코르티코이드에 의한 활성산소의 증가에 대한 기전을 연구하고자 하였다. 7주령 마우스에 하루 2시간씩 14일의 신체구금 스트레스 (restraint stress) 후 나타나는 우울-불안 행동을 정량적 측정이 가능한 행동실험들로 조사하였다. 우울증 행동이상 반응을 측정하는 행동실험 (social interaction test, tail suspension test, forced swim test)과, 불안증의 행동을 측정하는 실험(novelty suppressed feeding test, marble burying test, open field test)들에서 하루 2시간씩 14일 동안 반복적인 신체구금 스트레스로 인하여 우울 및 불안 행동 이상 반응 증가되었으며, 이러한 행동 증상은 스트레스 처치 종료 후 2-3주 이후에도 안정적으로 관찰되었다. 스트레스로 인하여 나타나는 우울 및 불안증의 행동이상 반응들은 마지막 스트레스 처치 후 16-18일 이후에도 안정적으로 탐지되므로 보아 하루 2시간씩 14일 동안 반복적인 스트레스 효과는 장기간 지속됨을 확인하였다. 이러한 스트레스 처치에 후의 발생되는 우울 및 불안증의 행동이상 반응들은 마우스뿐만 아니라 우울 및 불안증 환자에서도 나타난다. 우울증 환자에 처방되는 항우울제인 imipramine을 스트레스 처치 종료 후부터 15일동안 투여할 경우 스트레스에 의한 초래되는 우울 및 불안 행동 반응들이 사라짐을 확인하였다. 스트레스 처치 후 발생하는 활성산소종 스트레스의 정도를 확인하기 위하여 lipid peroxidation과 protein carbonylation 을 적용하는 생화학적 분석법으로 스트레스 처치 후 뇌의 해마 조직에서 활성산소종 스트레스가 행동 스트레스의 강도와 횟수 의존적으로 증가함을 확인하였다. 스트레스에 의하여 증가된 활성산소종의 작용 기전의 확인을 위하여 사람 신경아세포종 (SH-SY5Y)을 이용하여 스트레스 호르몬에 의한 활성산소의 증가 기전을 확인하였다. 활성산소종의 과산화수소수(Hydrogen peroxide)를 탐지하는 DCF와 초과산화물(superoxide)을 측정하는 DHE 염색법으로 글루코코르티코이드의 노출 시간과 농도 의존적으로 활성산소종의 증가를 관찰하였다. 스트레스에 의한 활성산소종의 증가하는 조절하는 유전자를 확인하고자 스트레스 투여 후 전두엽과 해마의 뇌 조직에서 활성산소종의 조절에 관여하는 유전자들의 변화를 Real-Time PCR으로 확인하였다. 활성산소종을 조절하는 유전자들 중 NADPH 산화효소 (NADPH oxidase)의 서브유닛인 p47phox와 p67phox가 반복적 신체구금 스트레스에 의하여 유의미하게 증가하였다. RT-PCR 방법을 이용하여 신체구금 스트레스에 의하여 p47phox와 p67phox의 증가를 재확인하였고, 다른 NADPH oxidase의 서브유닛들(gp91phox, p22phox, p40phox)의 발현 증가를 관찰하였다. 마우스 뇌조직뿐 아니라 사람 신경아세포종 (SH-SY5Y)에서 글루코코르티코이드 투여 후 p47phox의 발현이 증가함을 재확인 하였고, p47phox의 인산화를 방해하여 NADPH oxidase 활성 저해제인 Apocynin을 투여 시 글루코코르티코이드 투여에 의한 활성산소의 증가가 억제되었다. 또한, 마우스에서 신체구금 스트레스와 Apocynin을 투여한 경우 스트레스 처치에 따른 증가된 활성산소종이 감소되었고, 우울증 행동이상 반응이 또한 감소됨을 확인하였다. 이러한 결과로 스트레스 처치 후 반응으로 활성산소종의 생성 및 우울증 행동이상 반응에 NADPH oxidase가 중요한 역할을 함을 관찰하였다. 신경세포아종에서 p47phox의 발현을 si-RNA로 억제한 경우 스트레스 처치에 따른 활성산소종의 증가가 억제 되었다. 또한, p47phox의 발현이 감소된, Lenti p47phox-shRNA이 과 발현된 마우스와, p47phox +/- 마우스에서 스트레스 처치에따라 증가되는 우울증 행동반응이 스트레스를 처치하였음에도 불구하고 스트레스를 받지 않은 정상 쥐와 유사한 행동을 보였다. 본 연구에서 제시한 이러한 일련의 결과들에 근거할 때 반복적인 스트레스에 의해 뇌신경계에 증가하는 활성산소종의 생성 및 불안 및 우울증 행동이상 반응에 있어서 NADPH oxidase가 중요하게 작용함을 나타내는 것으로 보인다. 퇴행성신경질환인 알츠하이머성 치매에서 반복된 신 스트레스가 알츠하이머성 치매 발병(pathogenesis)에 미치는 영향과 그 기전을 조사하였다. 많은 연구자들의 임상 및 기초의학 에 따르면 스트레스에 의해 알츠하이머성 치매의 진행이 가속화되며, 마이토콘드리아의 기능 장애를 보고하고 있다. 그러나, 스트레스에 의한 알츠하이머성 치매의 진행의 가속화와 마이토콘드리아의 기능 장애를 초래하는 분자적 기전은 알려지지 않았다. 이에 본 연구는 잘 알려진 알츠하이머성 치매 마우스 모델인 Tg-APPswe/PS1dE9를 이용하여 잘 확립된 2h-16d 신체구금 스트레스 처치가 알츠하이머성 치매의 병리적 진행과 마이토콘드리아의 기능에 미치는 영향 및 기전을 연구하고자 하였다. Tg-APPswe/PS1dE9 마우스에서 뇌조직에 노인반이 침착되기 시작하는 시점인 6달부터 6.5달까지 반복적인 2시간 16일 동안 신체구금 스트레스 처치하였다. 반복된 신체구금 스트레스를 처치 후 노인반의 수가 급격히 증가하였고, ELISA의 방법으로 Abeta 40과 42의 정도가 증가되는 것을 확인하였다. 이 결과들은 만성 스트레스로 인하여 알츠하이머성 치매의 진행이 가속화됨을 시사하는 것으로 해석된다. Tg-APPswe/PS1dE9 마우스에 2h-16d 스트레스 처치 후 뇌조직에 활성산소종들이 증가하는 것을 관찰하였다. 알츠하이머성 치매 마우스에서 스트레스에 의한 활성산소종의 증가 기전을 확인하고자 신경아세포종에 Abeta와 글루코코르티코이드 투여 후 활성산소종의 정도를 관찰하였다. Abeta를 단독 투여보다 더 많은 활성산소종의 정도가 탐지 관찰되었고. 마이토콘드리아의 막전위가 Abeta를 단독 투여시보다 더욱 낮아짐을 확인하였다. 이에 따라 시상하부 분비호르몬의 대항물질인 NBI와 스트레스 호르몬인 글루코코르티코이드 길항근인 RU486을 함께 투여하여 시상하부-뇌하수체-부신피질 축의 활성을 억제한 경우 Abeta와 글루코코르티코이드에 의한 증가된 활성 산소와 마이토콘드리아의 장애가 억제되었다. 이로써 스트레스 호르몬에 의하여 Abate에 의한 활성산소종의 생성과 마이토콘드리아의 기능 장애를 증가시킴을 관찰하였다. 알츠하이머성 치매에서 활성산소의 증가와 미토콘드리아의 장애를 일으키는 유전자인 ABAD (the abeta-binding alcohol dehydrogenase/17beta-hydroxysteroid dehydrogenase type 10 (ABAD/HSD10)) 의 발현 정도를 스트레스에 의한 발현 정도를 관찰하였다. 신경아세포종에서 Abeta를 단독 투여보다 글루코코르티코이드를 함께 투여시 ABAD의 발현이 Abeta를 단독 투여보다 더 증가되었고, si-RNA로 ABAD의 발현을 억제한 경우 Abeta와 글루코코르티코이드에 의해 증가된 활성산소와 마이토콘드리아의 기능장애가 억제되었다. 이러한 결과들은 신경아세포종에서 Abeta와 글루코코르티코이드에 의한 활성산소와 마이토콘드리아 장애는 ABAD의 발현이 증가함으로서 강화되는 것을 시사한다. Tg-APPswe/PS1dE9 마우스에서 신체구금 스트레스 처치 후 뇌조직 내에 ABAD의 발현이 증가하였다. ABAD가 증가시 마이토콘드리아에 미치는 영향을 마이토콘드리아 복합체의 활성도 측정으로 확인한 결과 스트레스 처치에 따른 ABAD가 증가로 마이토콘드리아의 기능장애가 나타남을 관찰하였다. 본 연구에서 제시한 일련의 이러한 연구 결과들에 근거할 때 만성 스트레스 처치는 알츠하이머성 치매의 뇌조직에 ABAD의 발현을 증가시키고, 그에 따라 활성산소종들이 증가함으로써 Abeta 정도와 노인반 증가 및 마이토콘드리아의 기능 장애의 알츠하이머성 치매의 진행 가속화시킴을 시사한다.
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