치매발병 유전자 BACE 1의 전사조절 메커니즘

Abstract

Several lines of evidences show that amyloid β (Aβ) aggregates in the senile plaque manifest a key mechanism causing and developing Alzheimer's disease (AD). Aβ is formed from digestion of β-amyloid precursor protein (APP) by aspartyl protease β-site amyloid precursor protein cleaving enzyme 1 (BACE 1), presenilin 1 (PS 1) and presenilin 2 (PS 2). Expression and activities of both BACE 1 and PS 1 was reported to increase in human AD brain sample and experimental AD animal model, suggesting an involvement of these enzymes in AD pathogenesis. In blood of patients with AD and the mild cognitive impairment, known as pre AD state, significantly higher levels of homocysteine were previously found than that of control subjects. Homocysteine and its metabolic substrate S-adenosylhomocysteine (SAH) are key molecules involved in methionine cycle to regulate methylation status in DNA and protein in cells. Since methylation of DNA or histone regulates gene transcriptional activity through epigenetic mechanism, in this thesis I hypothesize AD-related genes, BACE 1, PS 1 as well as APP, increase through epigenetic modifications of cycle of methylation-demethylation of these genes, which results in progression of AD. In an attempt to see if DNA methylation is involved in the regulation of their genes, in this study, we used 4 different brain cells, human neuroblastoma SH-SY5Y cells, mouse microglial BV-2 cells, human astrocytoma U87 cells and human microglial HMO6 cells, and treated with 5-Aza-2'-deoxycytidine (5-aza-dC). 5-aza-dC is a well-known specific inhibitor of DNA methyltransferase (DNMT). After 24 hours of treatment, we measured levels of mRNA by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) and of protein by western blotting analysis. Bisulfite sequencing was used to analyze demethyled CpG sites in promoters and 5'-untranslational region (5'-UTR) of genes with of without treatment of 5-aza-dC. To test if CpG sites in promoters and 5'-UTR of BACE 1 gene transcription, we construct CpG sites-containing gene promoter fused with a luciferase reported gene [pGL2-mBACE 1 (-1.5kb)] and measured its promoter activity. Using human-derived SH-SY5Y, HMO6, U87 cells, 5-aza-dC treatment did not increase the expression of all three genes tested in this study. However, we found a remarkable increase in BACE 1 expression in a dose-dependent manner at both RNA and protein level only when used mouse-derived BV-2 cells. Bisulfite sequencing analysis reveled that 5-aza-dC treatment (10µM) significantly caused the demethylation of two CpG sites of 5'-UTR in mouse BACE 1 gene. An in silico analysis using a motif scan revealed that one of two CpG sites contains consensus sequences binding transcription factors, Sugnal transcuder and activator of transcription 3 (STAT3), CCCTC-binding factor (CTCF) and Brother of Regulator of Imprinted Sites (BORIS) family. Furthermore, these two CpG sites existed only in mouse, but not human, BACE 1, although there are ∼80% sequence homology in promoters and 5'-UTR of BACE 1 between two cell types. Unexpectedly, we failed to find luciferase activity in [(pGL2-mBACE 1(-1.5kb)]-transfected BV-2 cells while a significant activity was observed in HEK293-T cells transfected with this construct. In conclusion, our study demonstrates that methylation of two CpG sites in 5'-UTR of mouse BACE 1 may play a role in its transcriptional regulation. Use of these two CpG sites-containing gene promoter fused with a methylation site-free luciferase reporter gene is needed to confirm a role for DNA methylation in transcriptional regulation of mouse BACE 1.;Aβ의 축적으로 생성된 senile plaque는 Alzheimer's disease (AD)를 발병시키는 주요 기전으로 알려져 있다. Aβ는 amyloid precursor protein (APP)이 β-site amyloid precursor protein cleaving enzyme 1 (BACE 1), presenilin (PS 1), presenilin 2 (PS 2)에 의해 분해되어 생성되는 물질로써, BACE 1과 PS 1의 발현 및 활성은 치매환자의 뇌 샘플 및 치매 동물모델에서 연구되어 AD의 발병에 연관되어 있다고 보고되었다. 최근의 연구결과에 따르면, 치매와 치매의 전단계로 알려져 있는 경도인지장애 (mild cognitive impairment, MCI) 환자의 혈액에서 대조군에 비해 현저하게 높은 농도의 homocystein (Hcy)이 발견되었다. Hcy와 그 기질인 SAH는 methionine cycle에 연관되어 있는 매우 중요한 인자로서, 세포 내 DNA 및 히스톤 단백질의 메틸화를 조절한다. DNA와 히스톤 단백질의 메틸화는 전사인자의 활성을 방해하여 유전자의 발현을 감소시키기 때문에, 본 저자는 AD와 관련된 APP, BACE 1, PS 1 유전자가 탈메틸화됨에 따라 발현이 증가될 것이라는 가설을 세웠다. DNA 메틸화가 이 유전자들의 발현에 관여하는지 알아보기 위해서 본 연구에서는 4가지의 다른 뇌 세포를 이용하여 실험하였는데, 그 세포는 인간 신경모세포종 SH-SY5Y, 생쥐 신경소교세포 BV-2, 인간 성상세포종 U87, 인간 신경소교세포 HMO6이다. 이 세포들에 DNA methyltransferase (DNMT)의 억제제로 잘 알려져 있는 5-aza-2'-deoxycytidine (5-aza-dC)를 처리하였고, 24시간 뒤, RT-PCR과 western blotting analysis를 통해 mRNA 및 단백질의 발현을 측정하였으며, 5-aza-dC를 처리하기 전과 후에 유전자의 promoter와 5'-untranslational region (5'-UTR)의 DNA 메틸화를 비교하기 위해 bisulfite sequencing을 시행하였다. 그리고 5-aza-dC에 의해 탈메틸화가 일어나는 두 CpG가 유전자 전사조절에 관여하는지 알아보기 위해서 본 연구에서는 특정 CpG를 포함한 유전자의 promoter를 luciferase reported gene과 결합한 construct [pGL2-mBACE1 (-1.5kb)]를 제작하였고, 이 construct를 이용하여 promoter의 활성을 측정하였다. 본 연구에서 인간유래 세포주인 SH-SY5Y, HMO6, U87 세포를 이용한 실험에서는 5-aza-dC가 상기 수행한 세 유전자들의 발현에 영향을 주지 못하였지만, 오직 생쥐유래 세포인 BV-2 세포를 이용한 실험에서만 BACE 1의 mRNA와 단백질에서 농도 의존적으로 뚜렷한 발현증가를 발견하였다. 또한, bisulfite sequencing 분석을 시행한 결과에서 5-aza-dC (10µM)를 처리하였을 때 생쥐 BACE 1 유전자 5'-UTR의 두 CpG가 탈메틸화된 것을 알 수 있었는데, in silico 분석을 통해 두 CpG 중 한 CpG는 signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3), CCCTC-binding factor (CTCF) 및 brother of regulator of imprinted sites (BORIS) family 전사인자들이 부착할 수 있는 염기서열 내에 있는 것으로 확인되었다. 게다가 사람과 생쥐의 BACE 1 promoter와 5'-UTR의 상동관계는 약 80%가 일치하지만, 두 CpG는 생쥐의 BACE 1에서만 존재하고 사람의 BACE 1에는 존재하지 않는다. 하지만 기대와는 달리, 인간유래 HEK293-T 세포에 주입하였을 때 정상적으로 luciferase의 발현을 증가시키는 promoter 역할을 하는 [pGL2-mBACE1 (-1.5kb)]를 BV-2 세포에 주입한 뒤 시행한 promoter assay에서는 luciferase 활성을 관찰하는데 실패하였다. 결론적으로, 본 연구에서는 생쥐 BACE 1의 5'-UTR에 존재하는 두 CpG의 메틸화가 BACE 1의 발현에 역할을 할 수 있을 것으로 예상되며, 추후에 두 CpG를 포함한 promoter와 methylation site-free luciferase reporter vector를 결합하여 세포에 주입하는 실험이 필요할 것으로 생각한다.