실시간으로 일산화질소 와 산소를 측정하기 위한 전기 화학적 전류 측정 방식의 나노포어 센서 개발 및 그 생물학적 응용

Abstract

Recently there has been an increasing demand for detecting oxygen (O2) and nitric oxide (NO), which play important roles to regulate molecular signaling, using an electrochemical microsensor in biological condition. Electrochemical measurements of NO and O2 gas molecules have the advantages of brevity and directness. Therefore, in this thesis, we present the development and biological applications of a novel nanopore-based amperometric sensor exhibiting improved sensitivity, selectivity, and spatial resolution. Chapter I described the fabrication and characterization of a nanopore-based sensor for the detection NO and O2. For the preparation of the sensor, a Pt nanodisk electrode (100 nm ≤ disk radius ≤ 500 nm) was prepared and the Pt nanodisk was further etched to result in a nanopore in which the Pt base surface was platinized. Then either silanization or fluorization of the electrode glass insulator sheath were performed for the selective detection of NO or O2, respectively. The silanization was carried out by immersing the nanopore electrode in a silanizing solution (10% chlorotrimethylsilane solution) for 30 min followed by drying in air. On the other hand, the fluorization was done by dipping the electrode in a solution containg zpu:PGMEA = 1:5 for 30 min followed by UV curing for 20 min. The NO or O2 sensors composed of a Ag/AgCl wire counter/reference electrode and a silanized or fluorized nanopore working electrode, respectively. The different treatments of the working electrode insulator sheath surface, providing hydrophobic pore environments, allowed to discriminate between heterogeneous diatomic NO and homogeneous diatomic O2. In fact, the sensor characterization confirmed the silanized sensor showed improved selectivity to NO over general biological interferents, while the fluorized one exhibited enhanced selectivity and sensitivity to O2 even over similar diatomic gas molecule, NO. Chapter Ⅱ described the real-time monitoring of NO concentrations at mouse brain surface as well as inner-brain in vivo. First, two-dimensional image of the local NO concentrations for mouse brain cortex surface was obtained by utilizing the developed nanopore NO sensor (described in ChapterⅠ) as a NO-selective probe tip in scanning electrochemical microscopy (SECM). The obtained image also provided the information of horizontal as well as vertical NO synthase (NOS) enzyme distributions and agreed perfectly with confocal image of NOS+ neurons obtained by immunohistochemistry. NO measurements using the sensor at a single position of mouse brain with the administration of L-arginine confirmed the sensor performance while proving endogenous NO generating mechanism. In addition, NO concentrations were monitored while the sensor was penetrating the mouse brain vertically up to ~4000 m deep from the brain surface. The obtained data showed different NO concentrations as a function of the depth from the brain surface, and also showed a great agreement with the immunohistological data for NOS.;이 논문은 생체 내 신호 전달 역할을 수행하는 대표적인 두 기체 분자인 NO와 O2 를 효과적으로 측정 할 수 있는 전기 화학적 분석 방법으로써 전류 측정 방식의 나노포어 센서를 개발하여 생체 내 측정에 응용 실험을 하는 내용을 담고 있다. 크게 두 가지 주제로 나누어 볼 수 있으며 첫 번째 단원은 NO와 O2를 높은 선택성과 감응도로 측정 할 수 있는 나노포어 초미세 센서를 개발하는 내용을 담고 있다. 두 번째 단원에서는 개발한 전류 측정 방식의 나노포어 NO 센서로 쥐의 뇌에서 in vivo 응용 실험을 한 내용을 소개하고 있다. 각각의 단원에 대한 좀 더 구체적인 내용은 다음과 같다. 제1장의 내용은 기존의 전류 측정 방식의 나노포어 전극에 silanization과 fluorization의 처리를 하여 각각 NO, 그리고 O2에 선택적이며 감응도가 높은 센서의 개발 및 제작에 대한 내용이다. 두 센서 모두 동일하게 전기 화학적으로 에칭된 백금 전극(100 nm ≤ 디스크 반지름 ≤ 500 nm)을 작업 전극으로 하였고, Ag/AgCl 전선을 기준 전극으로 사용하였다. Silanization 처리는 30 분간 10% silaninizing 용액에 전극의 팁 부분을 담가두는 방식으로 간단히 진행되었고, fluorization 처리는 30 분간 fluorine 용액에 전극을 같은 방식으로 담근 후 추가적으로 UV 경화를 20 분간 진행함으로써 수행하였다. 두 센서는 각각의 표적 기체의 농도에 비례하여 전류 값이 변하는 역동적 반응 곡선을 얻었고, 그에 상응하는 직선의 보정 곡선을 이용하여 센서의 감응도 값을 구하였다. 또한 NO 센서의 경우 NO의 산화 전위(+0.75 V vs. Ag/AgCl)에서 동시에 산화되는 생물학적 방해종을 막아내는 것을 확인함으로써 NO 측정에 대한 센서의 성능을 확인하였다. 제 2장에서는 앞서 개발한 silanization 처리를 한 전류 측정 방식의 NO 나노포어 센서를 이용하여 생물학적인 in vivo 응용 실험을 수행한 결과를 논의하였다. 신경 전달 물질로서 중요한 역할을 수행하는 NO는 뇌 기능 연구에 있어 중요한 연구 소재이다. 이러한 NO가 NOS의 형태로 쥐의 대뇌 피질 특정 영역에서 확산되어 방출되는 모습을 전기화학적 주사 현미경(SECM: Scanning Electrochemical Microscopy)을 통하여 이미징하는 in vivo 실험을 수행하였다. 제작한 나노 포어 NO 센서를 SECM의 probe tip으로사용하여 NO의 농도의 이차원, 삼차원적 분포에 대한 정보를 이미지로 얻을 수 있었다. 또한 35.7 M의 L-arginine(L-Arg)을 쥐 대뇌 피질에 처리하여 L-Arg 첨가 이전과 이후의 NO 측정 농도 변화를 확인하였으며 이를 통해 NO 생성 메커니즘을 실험으로 확인하였다. 또한 좀 더 심층적인 신경계 기능에 대한 연구를 위하여 대뇌 표면에서의 NO 측정에서 나아가 수직으로 뇌를 뚫고 들어가면서 각 뇌의 내부 구조에 해당하는 위치에서의 NO flux를 측정하는 in vivo 실험도 수행하였다. 쥐 뇌의 각 위치마다의 NOS 분포 밀도에 대한 기존의 연구 결과들을 바탕으로 우리의 실험 결과를 맞추어 보며 기존 데이터와의 적합성을 직접 확인하였다.