대장암 세포주에서 microRNA-21과 PTEN 및 TIMP-3 발현과의 연관성

Abstract

마이크로 RNA(miRNA)는 20개 내외의 뉴클레오티드로 이루어져 있는 단일 가닥의 작은 비단백질 부호화 RNA로 상보적인 결합을 하는 특정 전령 RNA(messenger RNA, 이하 “mRNA”)에 결합하여 그 유전자의 발현을 조절하여 세포의 증식과 분화, 자멸 등과 같은 다양한 범위의 생물학적인 기능을 통제하는 역할을 한다. miRNA 중 하나인 마이크로 RNA-21(miR-21)은 암세포의 증식, 자멸(apoptosis)을 촉진하는 종양유전자로 추정되고 있으며 여러 종양에서 miR-21의 발현 증가가 보고되고 있지만 그 작용기전은 아직 자세히 밝혀지지 않았다. PTEN은 종양억제유전자로 암세포의 이동과 침범을 억제하고 세포증식을 억제하는 기능을 하는 것으로 알려져 있고 PTEN의 발현이 대장암의 재발과 치료 효과에 영향을 준다는 보고들이 있다. TIMP-3는 종양의 침습과 전이에 중요한 역할을 하고 대장암의 발생 및 침습에 중요한 역할을 한다고 알려져 있는데, PTEN과 TIMP-3는 miR-21과 상보적인 염기서열을 가지고 있어 miR-21의 표적 mRNA로 유추해 볼 수 있다. 최근 연구에서는 간암 세포주에서 miR-21의 발현 변화에 따라 반비례적인 발현 양상을 보인다고 보고하였고 miR-21이 TIMP-3에 작용하여 담관암과 유방암에서 침습을 조절한다고 보고하였다. 그러나 대장암에서 miR-21과 PTEN, TIMP-3의 관계에 대한 연구는 미미한 상태로 최근 국내의 한 연구에서 대장 종양조직에서 miR-21의 발현이 증가되어 있고 TIMP-3, PTEN 단백 발현이 감소되어 있음을 보고한 바 있으나 아직 국내의 대장암 세포주에서 miR-21과 PTEN, TIMP-3 사이의 연관성을 밝힌 연구가 없는 상태로 본 연구에서는 국내 대장암 세포주와 외국 대장암 세포주를 배양하여 miR-21의 발현 양상에 따른 PTEN, TIMP-3 단백발현 변화를 관찰하고 국내 대장암 세포주와 외국 대장암 세포주 사이에서 miR-21의 발현양상과 PTEN, TIMP-3 단백발현의 차이점을 규명하고자 하였다. 7개의 인체 대장암 세포주 HCT116, HT29, Lovo, DLD1, SNU-C2A, C4, C5를 사용하였으며 SNU-C2A, C4, C5는 몽골인종의 세포주를 선택하여 습윤 배양기에서 배양하였다. miR-21의 발현을 실시간 중합효소연쇄반응으로 측정하여 각 세포주들의 miR-21 발현양상을 HCT116에 대한 발현비로 측정하였고 PTEN과 TIMP-3의 mRNA 발현은 반정량 역전사 중합효소 연쇄반응으로, 단백발현은 western blot을 이용하여 측정하였다. 국내 대장암 세포주인 SNU-C2A, SNU-C4, SNU-C5는 모두 낮은miR-21발현을 보였고 HCT116, HT29는 높은 발현을 보였다. miR-21과 PTEN, TIMP-3 단백발현은 의미있는 연관성을 보이지 않았고(p>0.05) PTEN, TIMP-3 mRNA 발현도 통계적으로 유의한 연관성을 보이지 않았다(p>0.05). 그러나 한국 세포주 3개를 따로 분석할 경우 miR-21과 PTEN, TIMP-3 단백의 경우 통계적으로 유의한 연관성이 없으나 mRNA의 경우 miR-21과 음의 상관관계를 보이는 것으로 나타났다(p=0.00). 본 연구결과 miR-21과 PTEN, TIMP-3 mRNA, 단백발현과의 연관성은 찾을 수 없었으나 한국인 대장암 세포주에서는 miR-21과 PTEN, TIMP-3 mRNA가 역의 관계를 보여 miR-21이 전사 후 단계가 아닌 전사의 단계에도 관여할 수 있음을 확인할 수 있었다. ;Purpose: MicroRNAs (miRNAs) are small noncoding RNA molecules that regulate expression of target genes and have been related with the cancer proliferation, differentiation and apoptosis. Recent evidences indicate that the microRNA-21 (miR-21) expression is significantly elevated in several cancers and can function as like oncogenes. However, the tumor biologic function and mechanism of miR-21 remain largely unclear. The aim of this study was to define the relevance between miR-21 expression and phosphatase and tensin homolog (PTEN) expression (“Correlation A”), and the relevance between miR-21 expression and tissue inhibitor of metalloproteinase 3 (TIMP-3) expression (“Correlation B”) in colon cancer cell lines, to identify the function as biological target at molecular level of miR-21, and to elucidate the difference between Korean cancer cell lines and foreigner’s cancer cell lines in respect of Correlation A and Correlation B. Methods: miR-21 expression was investigated in 7 human colon cancer cell lines (including 3 Korean colon cancer cell lines) by real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction (real-time RT-PCR). In addition, the regulation of miR-21 over each mRNA and protein of PTEN, TIMP-3 was evaluated by semiquantitative RT-PCR and Western blotting. Results: In 7 colorectal cancer cell lines, 3 Korean cancer cell lines (SNU-C2A, SNU-C4 and SNU-C5) showed low endogenous miR-21 expression and HCT116, HT29 showed high endogenous miR-21 expression. There was no significant correlation between miR-21 and PTEN protein expression and between miR-21 and TIMP-3 protein expression (p>0.05), nor was significant correlation between miR-21 and TIMP-3 mRNA and between miR-21 and TIMP-3 mRNA (p>0.05). In 3 Korean colon cancer cell lines, however, we found a significant inverse correlation between miR-21 and PTEN mRNA (p<0.05) and between miR-21 and TIMP-3 mRNA (p<0.05). Conclusion: We did not found significant correlation between miR-21 and PTEN protein and between miR-21 and TIMP-3 protein. However, our finding in Korean cancer cell lines suggests that PTEN, TIMP-3 mRNA is negatively regulated by miR-21 and that miR-21 is a potential regulator at transcriptional level.