Anti-hypertensive Effects of Culture Filtrates of Bacillus Subtilis natto in Spontaneously Hypertensive Rats

Abstract

We investigated the anti-hypertensive effects of culture filtrates from Bacillus subtilis natto (CFB) and their underlying mechanisms in spontaneously hypertensive rats (SHRs). CFB did not show the inhibition of Angiotensin Converting Enzyme (ACE) activity at any tested concentrations. However, fibrinolytic activity was increased with the increase of CFB treated concentration in cell free system. The animals were fed two different experimental diets supplemented with 1% and 2% CFB (w/w), and their systolic blood pressures (SBP) were measured once a week for 11 weeks. Systolic blood pressure was significantly lower in the 1% and 2% CFB groups compared to the control group. Plasma renin activity and renal angiotensin II concentrations were also significantly lower in the 2% CFB group than in the control group. Renal renin expression showed a decreasing tendency in the 1% and 2% BNE groups compared to the 0% CFB group (P = 0.1357). In addition, fibrinolytic activity biomarkers including whole blood clotting time, ECLA, and D-dimer concentration showed a tendency to dissolve thrombus in the 1% and 2% CFB groups. Taken together, these findings demonstrated that CFB supplementation may modulate development of increased systolic blood pressure. This beneficial effect of CFB might be related to the inhibitory effects on Renin-Angiotensin System (RAS) as well as the thrombolytic activity.;나토키나제는 대두가 Bacillus subtilis natto에 의해 발효할 때 합성되고 방출되는 enzyme으로 정식 명칭은 Subtilisin NAT이다. 이는 경구 투여 시 체내에 흡수되어 간접적으로 plasminogen activator 생성을 활성화시켜 plasminogen에서 plasmin으로의 전환을 증가시키고, 이 plasmin이 응고 혈액의 fibrin을 용해시켜 fibrinolytic activity를 가지고 있다고 알려져 있다. 직접적으로 cross-linked fibrin을 분해 할 뿐만 아니라, 혈전 용해의 1차 저해제인 plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1)의 불활성과 분해 작용을 통해 혈전 용해 작용을 강화시킨다. 혈전은 질병, 식이 요인 등 다양한 원인에 의해 체내에 생성될 수 있으며 이는 혈압과도 밀접한 관련이 있고 나아가 심혈관계 질환의 위험 요소이다. 시판되고 있는 혈전 용해제는 혈전에 대해 선택성이 적은 점을 감안하고, 낫토균배양엑기스는 나토키나제 외에 아미노산, 이소플라본, 엔자임을 비롯한 체내에 유용한 여러 가지 영양소를 포함하고 있다는 점에서 경구로 섭취 가능한 혈압 조절 기능성 원료가 될 수 있다. 이에 본 연구에서는 새로운 낫토균배양엑기스 (Culture Filtrates of Bacillus subtilis natto, CFB)가 혈압 조절에 미치는 영향과 메커니즘을 규명하고자 하였다. 낫토균배양엑기스 자체의 특성을 확인하고자, Cell free 시험계에서 안지오텐신 전환 효소 (Angiotensin Converting Enzyme, ACE) 저해 및 혈전 용해 활성을 시험하였다. 실험 결과, 낫토균배양엑기스가 레닌-안지오텐신 시스템 (Renin-angiotensin system, RAS)에서 안지오텐신 Ⅰ에서 혈압 조절의 최종 요인인 안지오텐신 Ⅱ로 전환하는데 관여하는 안지오텐신 전환 효소의 활성을 저해하지 않았다. 하지만 피브린 평판법을 통해 낫토균배양엑기스 내 나토키나제의 혈전 용해 활성을 확인하였다. In vivo 시험계에서 고혈압 동물 모델 (Spontaneously Hypertensive Rats, SHRs)을 이용하여 혈압 감소에 미치는 효과와 이와 관련된 바이오마커의 변화를 탐색하고자 하였다. 정상 혈압인 Wistar Kyoto (WKY) rat을 SHR rat의 대조군으로 사용하였다. SHR rat을 초기 혈압에 따라 난괴법으로 표준식이군, 2% CFB 보충 (w/w) 표준식이군, 고콜레스테롤식이군 (0.5% cholesterol, 0.5% cholic acid), 1% CFB 보충 고콜레스테롤식이군, 2% CFB 보충 고콜레스테롤식이군으로 나누었다. 이는 고콜레스테롤 혈증으로 인한 혈관 기능 장애와 혈전 생성을 유도하고, CFB 보충이 혈압 조절에 미치는 효과를 보기 위함이다. 11주간 실험 동물의 수축기 혈압 변화를 관찰하였고 레닌 안지오텐신 시스템에 미치는 영향을 알아보기 위한 지표로 혈장 레닌 활성과 혈장 안지오텐신 II 농도 (Systemic RAS), 신장의 안지오텐신 II 농도와 레닌 발현 (Intrarenal RAS)을 측정하였다. 또한 혈전 용해 활성을 영향을 보기 위한 지표로 전혈 응고 시간, 유글로블린 응고 용해능, 피브린의 최종 분해 산물인 혈장 D-dimer 수준을 측정하였다. 실험 식이를 11주간 섭취한 결과, 표준식이군과 2% CFB 보충 표준식이군은 수축기 혈압 변화에 유의적인 차이가 없었다. 하지만 고콜레스테롤 식이에 CFB를 보충 섭취 시킨 군에서는 10주 차부터 1% CFB 보충군이 고콜레스테롤식이군에 비해 수축기 혈압이 유의적으로 낮아졌으며 11주 차에는 1, 2% CFB 보충군 모두 고콜레스테롤식이군에 비해 수축기 혈압이 유의적으로 감소하였다. 고콜레스테롤식이군 내에서 CFB 보충 수준에 따라 혈액에서 레닌-안지오텐신 시스템의 조절 제한 효소인 혈장 레닌 활성이 유의적으로 감소하였지만, 혈액의 안지오텐신 Ⅱ 수준에는 모든 군 간 유의적인 차이가 없었다. 하지만 신장의 안지오텐신 Ⅱ 수준은 고콜레스테롤식이군 내에서 2% CFB 보충군이 고콜레스테롤식이군에 비해 유의적으로 감소하였다. 웨스턴 블랏을 통해 신장 피질의 레닌 발현을 측정한 결과, 고콜레스테롤식이군 내에서 CFB 보충 수준에 따라 레닌 발현이 감소하였다. 또한 혈전 용해능을 알아보기 위한 전혈 응고 시간, 유글로블린 응고 용해능을 통해 유의적이지 않지만 CFB 보충에 따른 혈전 용해 기능의 경향을 확인하였다. 결론적으로 고혈압 동물 모델에서 고콜레스테롤식이에 낫토균배양엑기스 보충은 수축기 혈압을 감소시켰다. 뿐만 아니라 낫토균배양엑기스 보충 섭취는 혈장 레닌 활성의 감소와 신장의 안지오텐신 II 농도 감소, 레닌 발현을 감소시켰다. 또한 혈전 용해 작용 경향을 보임으로써, 낫토균배양엑기스의 혈압 조절 기능성을 확인할 수 있다. 하지만 낫토균배양엑기스에서 나토키나제 외에 PGA (poly-γ-glutamate) 등의 다른 고분자 물질의 혈압 조절 기능성과 구체적인 레닌-안지오텐신 시스템 관련 기전에 대한 후속 연구가 필요할 것이다.