A comparative study on cell viability of human periodontal ligament cells cultured from extracted teeth by the different cryopreservation methods

Abstract

Background Programmed slow freezing of periodontal ligament (PDL) cells for cryopreservation is a widely accepted procedure, and the rapid freezing combined with vitrification has been applied for cryopreservation of human cells with their improved post-thawing results. However, the effects of rapid vitrification freezing methods in cryopreservation of PDL cells were reported insufficiently. Purpose This is to evaluate the most favorable method for cryopreservation of human PDL cell. Rapid freezing with vitrification, slow programmed freezing and preconditioned freezing method were compared on the cell viability after cryopreservation of PDL cell. Materials and methods Three cryopreservation protocols were compared with control group (fresh PDL cells). PDL cell colonies were obtained through primary culture of PDL cells from the extracted premolar tooth for orthodontic purpose and were divided to four groups; rapid vitrification freezing, slow programmable freezing, preconditioned freezing and control group. 10% Dimethyl sulfoxide (DMSO) was used as the cryoprotectant agent (CPA) in slow freezing and preconditioned freezing group. For vitrification group, cells were incubated for 5 minutes in the solutions containing a combination of DMSO, 1, 2-propanediol (PrOH), ethylene glycol (EG) with polyvinylpyrrolidone (PVP). The MTT, TUNEL assay and immunofluorescence staining for alkaline phosphatase (ALP) were used for the comparison of viability and survival capacity of cells. Inverted microscopic morphology of PDL cells was examined for evaluation of the proliferation of the PDL cells after freezing, thawing and 24-hour culture. Results 1. PDL cells preserved by programmed slow freezing and preconditioned freezing maintained the physiological properties significantly better than those by the rapid vitrification freezing using a combination of 1, 2-PrOH, EG, DMSO and PVP. 2. MTT, TUNEL assay and immunofluorescence staining for ALP revealed also that the PDL cells were preserved better significantly after slow freezing and preconditioned freezing than after rapid vitrification freezing (P< 0.001). 3. Preconditioned freezing and slow programmable freezing group had significantly better physiological integrity of PDL cells than the vitrification group in fourth passage cells (P<0.05), but the difference of two groups was not significant statistically (P>0.05). 4. Vitrification group had the lowest value of MTT assay in both third and fourth passage cells (P<0.05), but there were differences between old passage and young passage cells in the effect of various CPAs. 5. The cell damage following to the vitrification in this study was the result of rapid freezing rather than toxic effect of vitrification solution. The effect of macromolecules, non-permeating CPAs (PVP) was specified. ;치아자가이식은 무치아 부위의 수복 시 임플란트를 대체하는 매우 유용한 임상적 방법이다. 발치치아를 즉시 식립할 수 없는 경우, 때로는 장기간보관이 필요하며 이러한 경우 보관할 수 있는 유일한 방법은 냉동보관이다. 치아자가이식에서 치주인대세포의 생존능력과 분화능력은 필수적이며 따라서 재식을 위한 치아 냉동보관 시 냉동 및 해동 후의 치주인대세포의 생물학적 특성의 보존은 가장 우선되어야 할 사항이다. 세포나 조직의 냉동 시 일어날 수 있는 손상은 크게 빙점에서 세포내외수분의 얼음결정 형성과 그에 따른 용질의 농도상승으로 인한 삼투압 쇼크로 나눌 수 있다. 저속 냉동 시 세포 내 수분의 얼음결정 형성은 감소하는 반면, 삼투압 변화는 증가하는 경향이 있다. 유리화(vitrification)를 이용한 급속냉동은 빙점에서 얼음결정을 형성하지 않고 생체를 고체화시키는 냉동방법이다. 얼음결정이 형성되지 않고 냉동 속도가 빠르며 고가의 장비가 필요하지 않다는 장점에도 불구하고, 유리화 시 가장 큰 문제점은 높은 농도의 냉동보존제와 그에 따른 독성으로 지적되고 있다.이에 사람치주인대세포에 대한, 유리화를 이용한 고속냉동과 기존의 저속냉동에 대한 비교실험을 시행하고 그 결과를 비교하여 그 임상적 유용성을 예측하고자 하였다. 치과교정치료를 목적으로 발치 된 제1소구치의 사람치주인대세포를 채득, 일차 배양 후 계대배양을 실시하였다. 3차 계대배양세포와 4차 계대배양세포를 실험에 이용하였으며, 유리화군, 저속냉동군, 전처리냉동군으로 나누어 실험하고 냉동 처리하지 않은 신선한 사람치주인대세포를 대조군으로 설정하였다. 유리화군을 위한 냉동용액은 1,2-프로판네디올, 에틸렌글라이콜(EG), DMSO, PVP가 혼합된 10% 유리화 용액으로 실험하였으며, 용액처리 후 세포가 든 냉동튜브는 영하196도의 질소탱크로 급속냉동되었다. 저속냉동군에서는 10%DMSO를 3%, 6%, 10% 순서로 단계별 용액농도 평형과정을 거쳐 적용하였으며 용액처리 후 세포는 실온에서 영하6.5도까지 분당 2도의 하강속도로 냉동, 영하6.5도에서 10분간 유지, 영하 35도까지 분당 0.3도의 하강속도로 냉동, 영하35도에서 10분간 유지 후 영하 196도의 질소탱크에 넣어 냉동보관하였다. 사람치주인대세포 냉동 시 기존에 사용해 오던 방법으로 냉동한 군을 전처리냉동군으로 설정하였는데, 냉동보존액은 10% DMSO이며 영하85도의 이소프로파놀 중탕 (isopropanol bath)에 냉동튜브를 부유(suspension)시켜 약 분당 1도정도의 속도로 냉동시킨 후 질소탱크에 넣어 냉동하였다. 냉동 후 해동은 37도의 중탕에 넣는 급속 해동방식을 적용하였고, 해동 후 각각의 냉동방법의 효과를 평가하기 위하여 MTT, TUNEL, ALP에 대한 면역형광염색을 시행하여 관찰하였다. 냉동 및 해동 후의 사람치주인대세포의 생존능력 평가를 위한 MTT 실험의 결과수치는 ANOVA, Multiple comparison test 및 t-test를 시행하여 통계 및 분석하였다. 실험결과 3차 계대배양세포실험에서는 저속냉동군이 가장 양호한 결과를 나타내었다. 4차 계대배양세포실험에서는 저속냉동군과 전처리냉동군이 유의성 있게 급속냉동군보다 좋은 결과를 보여주였으며 두 군간의 통계학적 차이는 없었다. 두 세포 모두 급속냉동의 세포 보존 효과가 가장 낮았다. 3차계대배양세포와 4차계대배양세포간의 실험결과 비교 시, 실험수치가 각 군에서 통계학적으로 유의성 있는 차이를 보였다. 급속냉동군에서 비투과성 냉동보존액인 PVP의 효과를 특기(specification)하기 위해 PVP가 포함되지 않은 급속냉동군의 추가실험에서는 PVP의 효과가 유의성있게 입증되었다. 또한 급속냉동을 위한 유리화 용액의 농도를 5%로 낮추어 시행한 실험에서도 세포의 생존능력은 기존냉동법이나 저속냉동법에 비해 현저히 낮은 결과를 보였다. 냉동 후 세포의 생물학적 혹은 생리학적 성질의 보존을 위해서는 각각의 세포나 조직의 냉동에 맞는 cryoprofile 필요하며, 이는 냉동보존액의 종류, 농도, 처리시간, 처리시 온도, 단계별 용액농도 평형과정(equilibration)의 유무, 냉동속도, 냉동방법, 냉동보관 기간 그리고 세포의 생물학적 특성에 따라 특기될 것이다. 치아재식 시 사람치주인대세포의 생존능력과 분화능력의 보존은 가장 중요하게 고려되어야 할 사항이다. 따라서 치아 재식을 위한 치아의 냉동은 사람치주인대의 보존이 필수적 사항이다. 의학 분야에서의 미래의 냉동기술은 물에 대한 물리화학적 연구와 이해 및 냉동기술의 발전을 기초로 하여 향상될 것이며, 그 임상적 유용성이 더욱 증가할 것으로 보인다.