SYNTHESIS OF THERMOSENSITIVE INJECTABLE HYDROGELS AND THEIR APPLICATION TO CARTILAGE REGENERATION

Abstract

Amphiphilic block copolymers can self-assemble into micelles in water, and can further form thermosensitive gels. Thermosensitive and biodegradable amphiphilic block copolymers were designed and synthesized based on poly(ethylene glycol) (PEG) as hydrophilic block to use as a three-dimensional (3D) cell culture system. First polymer was Pluronic F127 modified with telechelic ionic peptides, either anionic Gly-Phe-Gly-Asp (GFGD) or zwitterionic Gly-Arg-Gly-Leu (GRGL) or Gly-Arg-Gly-Asp (GRGD). All block copolymers formed micelles, but only those bearing zwitterionic peptides formed thermoreversible nanoassembly, micellar aggregates. This aggregates associated to form a gel only in a certain temperature range at higher polymer concentration. The gelation, evidenced by cryo-transmission electron microscopy images, involves radial growth of micelle aggregates, which is strikingly different from that of Pluronics driven by simple unimer-to-micelle transition. The RGD-containing copolymer is of particular interest, in that it is capable of binding to cell-surface adhesion receptors. Second polymer was PEG-b-poly(ethyl-2-cyanoacrylate) (PEG-PEC). PEG-PEC aqueous solutions showed an unusual closed-loop phase behavior. As the temperature increased from 0 oC to 60 oC, the aqueous polymer solution (12.0 wt.%) underwent sol-to-gel-to-syneresis transition. However, the polymer aqueous solution persisted as a sol phase below 4.0 wt.% as well as above 16.0 wt.% in the same temperature range, thus forming a closed-loop gel domain in the phase diagram. The closed-loop gel domain is suggested to be a result of the balance between the aggregation and stabilization of micelles in specific temperature and concentration ranges. Third polymer was poly(alanine) end-capped poloxamer (PA-PLX-PA). Polymer aqueous solutions also underwent sol-to-gel transition as the temperature increased. Based on FTIR spectra, circular dichroism spectra, 13C-NMR spectra, TEM images, fluorescence spectra, and dynamic light scattering studies, increases in the β-sheet conformation of the PA and dehydration of the PLX were suggested as the sol-to-gel transition mechanism. To see the feasibilities of hydrogels, viability of chondrocytes in polymer aqueous solutions as a function of concentration and durability of hydrogels were investigated. In comparison to the negative control, PLL, FGM, FGM-GRGD, PA-PLX-PA showed relative high cell viability. The PA-PLX-PA gel significantly prolonged the gel duration of F127 from a few days to more than 1 month in vitro, while PEG-PEC and FGM-GRGD hydrogels showed poor durability (less than ten days). The gel permeation chromatogram of the remaining PA-PLX-PA hydrogel in the rat showed decrease in the molecular weight over 15 days, whereas there was no change in molecular weight when incubated in PBS over the same period of time at 37 oC. PA-PLX-PA hydrogel is very stable in vitro and selectively degradable in vivo. Through these experiments, PA-PLX-PA copolymer show great potential as a desirable 3D cell culture system. 3D cell culturing in an artificial matrix needs understanding on the dynamic microenvironments of extracellular matrix and cells. One of the important factors is the mechanical properties (modulus) of the matrix. We investigated a thermal gelling PA-PLX-PA aqueous solution for chondrocyte 3D culture, focusing the initial polymer concentration of the polymer aqueous solution. As the polymer concentration varied over 7.0 wt.%, 10.0 wt.%, and 15.0 wt.%, the nanostructure of the in situ formed gel showed increased population and thickness of the nanofibers. In addition, modulus of the in situ formed gel increased over 350 ~ 380 Pa, 2100 ~ 2300 Pa, and 5300 ~ 5700 Pa, respectively. Chondrocytes kept their spherical phenotypes in the 3D environment of in situ formed hydrogel and showed excellent cell viability, increased production of sGAG and type II collagen in PA-PLX-PA gel prepared from initial polymer concentration of 7.0 wt.% and 10.0 wt.%. At 15.0 wt.% of initial concentration, viability, proliferation, and differentiation of the chondrocytes significantly reduced, emphasizing the significance of the micromechanical environments for the 3D cell culture. For the next study, the secondary structures of PA-PLX-PA hydrogels were regulated by varying L-Ala/DL-Ala ratio of PA. The secondary structural difference led to a difference in the nanostructures of PA-PLX-PA thermogels which were used as a 3D culture platform for chondrocytes. In particular, the fraction of the β-sheet structure of the polyalanine dictated the population and thickness of fibrous nanostructure of the hydrogel, which in turn affected the proliferation and differentiation of the encapsulated chondrocytes. The research suggests that control of nanostructure of the 3D environment of a hydrogel as a culture medium plays an important role in the redifferentiation of chondrocytes into articular cartilages. As an injectable tissue engineering system of chondrocytes, very promising results were confirmed for nude mice, using the current polypeptide aqueous solution. This thesis not only provided important clues in designing an artificial extracellular matrix but also proved the significance of thermal gelling polypeptide as a minimally invasive tissue engineering scaffold.;본 연구는 온도에 민감한 고분자를 합성한 후, 그 중 연골세포의 배양에 적절한 물질을 찾는 것을 목표로 하였다. 먼저 PEG를 친수기로 고정하고 다양한 소수기를 사용하여 온도 민감성 고분자를 합성 및 분석하였다. 세포의 접착을 증가시키는 펩타이드인 동시에 양쪽성 이온인 RGD를 함유한 Pluronic F127 유도체인 FGM-GRGD는 수용액에서 온도에 민감한 자기조립으로 나노 입자를 형성하며 졸에서 젤로 전이가 되었다. 접착제로 사용되고 있는 에틸시아노아크릴을 PEG에 결합시킨 PEG-PEC 고분자는 특정 농도와 온도 범위 안에서만 졸에서 젤로 변하는 “closed-loop” 형태의 졸-젤 전이를 보였다. PLX에 올리고펩타이드인 poly(alanine)을 결합시킨 PA-PLX-PA 수용액 또한 온도에 민감하게 졸-젤 전이를 보였다. 이 고분자 수용액을 IR과 CD로 분석한 결과, 온도가 증가함에 따라 β-sheet 구조가 증가된다는 것을 알 수 있었다. 이와 같은 온도 민감성 고분자 수화젤의 조직 공학적 응용 가능성을 확인하기 위하여 연골 세포의 세포생존성과 젤 유지기간을 검사하였다. 검사 결과 FGM, FGM-GRGD, PA-PLX-PA는 60% 이상의 비교적 높은 세포 생존성과 체외에서 한달 이상의 안정성을 보였다. 특히 15일 동안 쥐의 체내와 체외에서 in situ로 형성한 PA-PLX-PA 수화젤의 안정성을 비교한 결과, 체외에서는 매우 안정하여 분해가 전혀 일어나지 않은 반면 체내에서는 분해가 일어남을 보여주었다. 이와 같이 선택적으로 체내에서만 분해되는 특성은 주사 가능한 생체 물질로써 사용 가능성이 매우 유망하다는 것을 제시한다. 생체는 세포와 ECM으로 이루어진 거대한 수화젤이라고 볼 수 있다. 따라서 생체 조직이 손상되었을 때 재생을 돕는 데 있어 수화젤 시스템은 효과적으로 응용 가능한 분야이다. 특히 졸 상태에서의 온도 민감성 수화젤을 세포와 혼합한 후 인체에 주사할 경우, 체온에서 젤로 변하기 때문에 상처 없이 간단하게 3차원 세포배양 시스템을 형성하는 장점이 있다. 3차원 세포배양 시스템은 최대한 세포외기질(extracellular matrix; ECM)을 모방하는 것이 효과적이다. 체내에서 3차원적으로 ECM에 둘러싸여 자라던 연골세포를 분리하여 2차원적으로 배양하면, 증식 면에서는 뛰어난 반면, 본연의 표현형을 잃어버린다는 단점이 있다. 이러한 단점을 극복하기 위하여 수화젤이나 다공성 지지체 시스템이 연구되어 왔다. 본 연구에서는 앞서 주사 가능한 생체물질로써의 가능성을 보인 PA-PLX-PA를 연골세포의 3차원 배양에 응용하였다. PA-PLX-PA (L-Ala/DL-Ala = 60/40)는 β-sheet 구조가 우세한 2차 구조적 특성을 가지며, 나노섬유의 3차 구조를 형성하였다. 수용액 중 PA-PLX-PA의 농도를 증가시켰을 때 수화젤 내부의 나노섬유 밀도와 두께가 증가하였고 젤의 강도 역시 증가하였다. 이와 같은 특성을 바탕으로 배양 시스템의 초기 강도가 연골 세포에 끼치는 영향을 살펴본 결과, 농도가 증가함에 따라, 즉 젤의 강도가 증가함에 따라, 세포의 생존률과 증식, 분화가 억제되었다. 이 결과를 통해 세포를 3차원적으로 배양함에 있어서 미세환경의 조절이 매우 중요하다는 것을 알 수 있었다. 더 나아가, 수용액 상태에서 온도에 민감하게 졸-젤 전이가 일어나는 PA-PLX-PA 고분자 내 PA 블록의 L-알라닌과 DL-알라닌의 비율을 다르게 함으로써 수용액 상에서의 2차 구조, 특히 β-sheet 구조와 random coil 구조를 조절하여 연골세포의 증식과 표현형 및 분화에 끼치는 영향을 알아보았다. L-PA로 구성된 PI은 나노섬유가 가장 조밀하게 잘 정렬된 반면, DL-PA로 구성된 PIII는 비교적 가늘고 정렬되지 않은 나노섬유로 이루어진 구조적 특징을 보였다. L-PA/DL-PA의 비율이 60/40인 PII는 PI과 PIII의 중간적인 특징이 관찰되었다. 이러한 차이는 연골세포의 증식과 분화에도 다른 영향을 끼쳤다. PA-PLX-PA 수용액을 연골세포와 혼합한 후 쥐의 피하에 주사하여 젤을 형성시킨 채 한 달 동안 관찰한 결과, 이 물질은 연골 재생 연구에 있어 주사 가능한 조직 공학적 시스템으로써의 가능성을 보여주었다.