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Insulin-like Growth Factor-I이 골격근세포에서 Toll-like receptor4 및 목표유전자 발현변화에 미치는 영향

Title
Insulin-like Growth Factor-I이 골격근세포에서 Toll-like receptor4 및 목표유전자 발현변화에 미치는 영향
Other Titles
Effects of Insulin-like Growth Factor-I on the Toll-like receptor4 gene expression in C2C12 muscle cells
Authors
김혜진
Issue Date
2010
Department/Major
대학원 체육과학과
Publisher
이화여자대학교 대학원
Degree
Master
Advisors
이원준
Abstract
본 연구의 목적은 Insulin-like growth factor-I(IGF-I)이 Toll-like receptor4(TLR4) 유전자 및 목표유전자 발현에 어떠한 영향을 미치는가에 대하여 알아보는 것이다. 실험대상으로는 쥐의 골격근 줄기세포(stem cell)인 C2C12 세포를 사용 하였으며, 분화과정 동안에 IGF-I을 농도별 조건과 시간별 조건으로 처리하여, TLR4 및 목표 유전자인 IL-6, TNF-a, NF-kB의 유전자 발현변화를 보았다. 또한, PI3-K/Akt의 억제제인 Wortmannin과 LY294002, p38 MAPK와 ERK 억제제인 PD98059와 SB203580을 분화배지로 배양액을 교체하는 과정에서 IGF-I과 함께 처리함으로써 IGF-I의 하부신호 전달경로로써의 TLR4 유전자 발현변화에 어떠한 영향을 주는지 알아보고자 하였다. 각각의 시약처리에 의한 유전자 발현변화 확인방법은 Real time PCR을 이용하여 mRNA 수준을 확인 하였고, Western blot기법을 사용하여 단백질 발현변화 수준을 확인 하였다. Western blot analysis에서 TLR4의 단백질 발현은 IGF-I 200ng/ml의 농도에서 통제군에 비해 단백질 발현이 감소하는 경향을 보였다. LY203580, Wortmannin을 IGF-I과 함께 처리한 실험에서 TLR4의 단백질발현은 억제제 처리군이 IGF-I 처리군과 비교 하였을 때 증가하였음을 확인할 수 있었으나, SB230580과 PD98059의 처리 시에는 억제제 처리군 모두가 IGF-I 처리군과 비교하여 TLR4 발현에 별다른 차이가 없었다. 따라서 본 연구는 IGF-I이 골격근 세포내에서 TLR4 유전자와 그의 목표유전자인 IL-6, TNF-α 그리고 TLR에 의해 조절되는 NF-kB의 유전자 발현을 감소시킨다는 사실을 세포수준에서 검증하였으며, IGF-I의 하부신호 전달 경로인 PI3-K/Akt의 억제제를 처리한 조건에서 TLR4 유전자의 발현이 증가하는 경향을 나타내는 것을 바탕으로 이들이 TLR4 유전자 발현 감소에 영향을 미친다는 사실을 검증하였다. real time PCR로 유전자 발현변화를 확인한 결과, IGF-I 농도별 처리에 의한 TLR4의 mRNA 수준은 200ng/ml의 조건에서 가장 큰 감소를 나타내었다. IGF-I에 대한 IL-6, TNF-α, 그리고 NF-kB subunit중 RelB와 p52의 mRNA 수준역시 모두 유의하게 감소하였다. IGF-I과 함께 LY294002를 처리 하였을 때, TLR4의 mRNA 수준이 200uM의 농도를 제외하고는 모두 유의하게 증가하였고, Wortmannin의 처리에서는 50nM, 400nM의 조건에서 유의하게 TLR4 mRNA가 유의하게 증가하였다. SB203580 및 PD98059의 처리에 의한 TLR4의 mRNA수준은 PD98059의 경우 유의한 증가가 확인 되었지만 SB203580의 경우 별다른 증가는 없었다. 결론적으로 IGF-I에 의한 TLR4 및 목표유전자 발현감소 결과에 있어서 IGF-I에 의해 활성화된 PI3-K/Akt가 중추적인 역할을 한다고 결론지을 수 있으며, IGF-I의 또 다른 경로이며 TLR4의 목표유전자인 NF-kB의 활성화에 기여하는 p38 MAPK와 ERK는 IGF-I에 의한 TLR4 발현감소에 있어서 별다른 영향을 미치지는 못한다고 결론지을 수 있다.;The purpose of the present study was to investigate the effect of IGF-I on TLR4 gene expression in skeletal muscle cells and the role of the downstream signaling pathways of IGF-I on IGF-I-induced suppression of TLR4 gene expression. C2C12 cells were treated with IGF-I in the absence or presence of various inhibitors of PI3-K(LY294002), Akt(Wortmannin), p38 MAPK(SB203580), and ERK(PD98059). Treated of C2C12 cells with IGF-I resulted in decrease in TLR4 protein expression. Inhibition of the PI3-K pathway with LY294002 or Wortmannin significantly blocked IGF-I-induced down-regulation of TLR4 protein expression, suggesting that this pathway is involved in IGF-I-induced TLR4 suppression. However, the level of TLR4 protein expression suppressed by IGF-I was not effected by inhibitors of p38 MAPK(SB203580) or EKR(PD98059), witch suggests that these pathways are not necessary for the inhibitory effect of IGF-I on TLR4 protein expression in skeletal muscle cells. To test whether the decrease in TLR4 protein expression was associated with TLR4 transcript, TLR4 mRNA levels after treatment with IGF-I were determined by real-time PCR. TLR4 mRNA was significantly decreased by IGF-I and inhibitory effect of IGF-I on TLR4 mRNA expression was blocked by LY294002 or Wortmannin. Furthermore, the modulating effect of IGF-I on TLR4 mRNA expression were significantly suppressed by p38 MAPK inhibitor (PD98059). Taken together, these results suggest that the down-requlation of TLR4 gene suppression mediated by IGF-I in skeletal muscle cells is regulated at least in part by the PI3-K/Akt and p38 MAPK pathways.
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