대장암 세포주에서 마늘추출물 diallyl disulfide에 의한 세포자멸사 유도 효과

Abstract

Allium vegetables are widely consumed and their beneficial effects on health are well-known. The association between consumption of Allium vegetables and risk for cancer has been assessed in many epidemiologic studies. The anticancer effects of Allium vegetables are attributable to organosulfur compounds (OSCs), which are released from the vegetables upon their processing. Several mechanisms have been proposed to explain the anti-cancer effects of Allium vegetables. These include modulation of enzyme activities, inhibition of DNA adduct formation, free-radical scavenging, inhibition of tumor cell growth, and induction of apoptosis. Numerous publications have indicated that OSCs correlate with the suppression of cancer cell growth and induction of apoptosis in several kinds of human cancer cells, including gastric cancer. In colon cancer, the anti-cancer effects of OSCs were reported by some investigators, although the definite mechanism has not been established. In this study, the anti-cancer effects of diallyl disulfide(DADS), a well-known OSCs from garlic, were investigated in terms of human colon cancer cell line proliferation and induction of apoptosis. The molecular mechanism of apoptosis induced by DADS was then analyzed. Two human colon cancer cell lines, HCT116 and HT29, were cultured and treated with various concentrations of DADS (0, 10, 100, 500, 1000, and 2000 μM). The viability of cultured cells was determined by MTT assay. To detect the induction of apoptosis, flow cytometric analysis was performed after Annexin V-FITC/PI staining. The distribution of cells in the cell cycle was investigated by a flow cytometric analysis. Then, using Western blot analysis, the expressions of DR4, DR5, caspase-8, and FLIP were measured. When treated with various concentrations of DADS, the viabilities of both colon cancer cell lines were reduced to 43.6% in HCT116 and to 45.3% in HT29 in a dose-dependent manner(p<0.001). There was a negative correlation between viability of colon cancer cells and concentration of DADS. In both cell lines, the apoptosis portion (positive Annexin V/negative PI area) of DADS-treated cells gradually increased according to the concentration of DADS. In cell cycle analysis, the percentage of sub-diploid DNA content increased from 8.7% at control to 19.25% at 2000 μM in HCT116 and from 6.71% at control to 14.12% at 2000 μM in HT29. However it was not clearly proportional to the concentration of DADS. The expressions of DR4, DR5, caspase-8 increased, while that of FLIP decreased in a dose-dependent manner in HCT116. While the expression of DR5 increased in a dose-dependent manner in HT29, the expressions of DR4, caspase-8, FLIP did not change according to the concentration of DADS. In conclusion, DADS inhibited the proliferation of colon cancer cells and induced apoptosis in a dose-dependent manner. The extrinsic pathway of apoptosis might be involved in DADS-induced cell death of HCT116 colon cancer cell line.;Allium vegetables는 전 세계적으로 사용되는 식재료일 뿐만 아니라 건강식품으로 널리 알려져 있다. Allium vegetables의 항암효과에 대해 여러 역학적 연구가 이루어졌고, Allium vegetables의 섭취가 암 발생이나 암 사망을 줄일 수 있는 것으로 확인되었다. Allium vegetables에서 이러한 항암효과를 나타내는 활성물질은 총칭하여 organosulfur compounds(OSCs)라고 불리며 이는 식물을 자르거나 씹는 과정에서 방출되게 된다. 항암효과에 대한 기전에 대해서는 여러 가설이 있으며, 발암물질의 대사효소의 조절, 발암물질과 DNA의 결합 방지, 유리기의 제거, 세포 증식의 억제와 세포자멸사의 유도 등이 제시되고 있다. 그 중에서 OSCs에 의한 종양세포의 성장 억제와 세포자멸사의 유도는 최근 많은 연구가 진행되고 있는 주제로 위암 등의 소화기계 종양에서도 일부 보고가 있었다. 그러나 대장암에서는 OSCs의 항암 효과에 대해 소수의 연구만이 진행되었고 그 작용기전은 아직까지 명확하게 알려져 있지 않다. 이에 대표적인 OSC인 diallyl disulfide(DADS)와 대장암 세포주를 이용하여 대장암에 대한 OSCs의 항암효과를 알아보고자 하였다. 대장암 세포주 HCT116과 HT29를 배양하여 다양한 농도의 DADS로 처리한 후 MTT 분석을 통하여 생존한 세포를 확인하여 DADS의 종양세포에 대한 성장 억제 효과를 확인하였다. Annexin V-FITC 염색을 이용하여 세포자멸사를 확인하고, 세포주기 분석을 통하여 DADS가 세포주기에 미치는 영향을 분석하였다. 또한 western blot 방법으로 세포자멸사에 관여하는 물질로 예측되는 DR4, DR5, caspase-8, FLIP 등의 발현을 관찰하였다. DADS는 HCT116 세포주와 HT29 세포주 모두에서 세포증식을 억제하였고, 이는 DADS의 농도 증가와 비례적인 관계를 보였다. 그리고 DADS를 처리한 대장암 세포는 Annexin V 염색을 이용한 분석에서 대조군에 비해 세포자멸사가 일어난 세포의 비율이 높았으나 이는 HCT116 세포주와 HT29 세포주간에 차이가 있었고, 세포주기 분석에서는 HCT116 세포주는 DADS 농도에 따라 세포자멸사가 증가하는 경향을 보였으나 HT29 세포주는 그러한 경향을 보이지 않았다. Western blot에서는 HCT116 세포주에서는 DR4, DR5, caspase-8이 증가하고 FLIP이 감소하였으나 HT29 세포주에서는 DR5만이 DADS농도에 따른 증가를 보였다. 결론적으로 DADS는 대장암 세포주 HCT116과 HT29의 세포 증식을 억제하고 세포자멸사를 유도하는 것으로 확인되었다. 그러나 이러한 작용은 HCT116 세포주에서는 명확하였으나 HT29 세포주에서는 그 정도가 다소 미약하였다. 또한 HCT116 세포주는 DADS농도에 따라 비례적으로 DR4, DR5, caspase-8의 발현은 증가하고 FLIP의 발현은 감소하는 결과를 보여 세포자멸사의 기전에 extrinsic pathway가 작용한다고 생각되었다. 하지만 HT29 세포주에서는 DR5만 발현이 증가되고 다른 물질들은 DADS 농도에 따른 변화가 명확하지 않았다. 따라서 HCT116 세포주와 HT29 세포주의 특성에 대한 연구를 통해 DADS에 대한 감수성의 차이를 보이는 원인을 확인하여야 할 것으로 보이며 추후 세포자멸사에 관여하는 다른 물질들과의 연관성에 대해서도 추가적인 연구를 진행해야 할 것으로 생각된다.