Characterization of Biodegradation for Methane and Volatile Organic Compounds

Abstract

Climate change caused by greenhouse gases (GHGs) has been arising environmental problems such as threatening Earth’s ecosystem. The main GHGs include carbon dioxide (CO₂), methane (CH₄), nitrous oxide (N₂O), fluoro-gases (HFCs, PFCs, SF_(6)), and volatile organic compounds (VOCs). In this study, the characterization of biodegradation for methane and VOCs was investigated and the interaction between methane and VOCs was also evaluated in simultaneous biodegradation of methane and VOCs. The specific objectives of this study are; (1) to evaluate the characteristics of biodegradation for methane and VOCs, (2) to investigate the effects of substrate interactions on the biodegradation, and (3) to examine the effects of transient loading condition on microbial activities and removal efficiency of VOCs-removing biofilter systems simulated to field conditions. Landfill cover A (LCA), landfill cover B (LCB), riparian wetland (RW), and forest (F) soils were used as inoculum sources to obtain methane- (M) or benzene and toluene- (BT) or MBT-degrading enrichment cultures, separately. LCA, LCB, and RW could degrade M but not F. The specific M degradation rates in M-degrading enrichment cultures were similar irrespective of inoculums source, however those were higher than MBT-degrading enrichment cultures (except for RW). All samples could degrade BT, but the specific BT degradation rates in BT-degrading enrichment cultures for LCA and LCB were higher than RW and F. The interaction of methane (M) and benzene (B) during oxidation in enriched M-oxidizing consortium (MOC) and in B-oxidizing consortium (BOC) from landfill cover soil was characterized. Oxidation of both M and B occurred in the MOC due to the coexistence of bacteria responsible for B oxidation, as well as methanotrophs, whereas in the BOC, only B was oxidized, not M. Oxidation rates of M and B in the MOC significantly decreased with increasing mole ratios of M to B. The B oxidation rate in the BOC was not affected by the coexistence of M or by the ratio of B to M. On the other hand, Rhodococcus sp. EC1 was isolated and shown to have an excellent cyclohexane-degrading ability. In addition to its cyclohexane degradation abilities, EC1 was also able to strongly degrade hexane. Moreover, EC1 could use other hydrocarbons including methanol, ethanol, acetone, methyl tert-butyl ether, pyrene, diesel, lubricant oil, B, T, ethylbenzene, m-xylene, p-xylene and o-xylene. In addition, a novel bacterial strain, Rhodococcus sp. EH831, was also isolated from the enriched hexane-degrading consortium, which was able to degrade hexane and various hydrocarbons including alcohols, chlorinated hydrocarbons, cyclic alkanes, ethers, ketones, monoaromatic and polyaromatic hydrocarbons, and petroleum hydrocarbons. The hexane degradation pathway was assessed through the qualitative analysis of the hexane intermediates by EH831, which were 2-hexanol, 2-hexanone, and 5-hexen-2-one, in that order, followed by 4-methyl-2-pentanone, 3-methly-1-butanol, and butanal, and finally CO₂. The substrate interactions of benzene, toluene, ethylbenzene, xylene, and methyl tert-butyl ether (BTEXM) in binary, ternary, quaternary, and quinary mixtures by Rhodococcus sp. EH831 that could aerobically degrade all of five single components. In binary, ternary, quaternary, and quinary mixtures of them, ethylbenzene was the strongest inhibitor for the other substrates, and methyl tert-butyl ether was the weakest inhibitor. The performance of a polyurethane (PU) biofilter inoculated with Rhodococcus sp. EH831 was evaluated under different transient loading conditions, such as shutdown, intermittent and fluctuating loading. When the biofilter was restarted after a 2-week shutdown, the BT removal capacities were rapidly restored after a re-adaptation period of only 1 day. The result of quantitative real-time PCR demonstrated that Rhodococcus sp. EH831 could be maintained (1010 to 1011 CFU?g-dry PU-1) during transient loading periods irrespective of the different operating conditions. These findings collectively suggest that M-, BT-, MBT-degrading consortia, Rhodococcus spp. EC1, and EH831 can be a useful biological resource for removal of methane, cyclohexane, hexane, and other recalcitrant hydrocarbons. Furthermore, our findings would be helpful in the development of bioremediation methods and in the prediction of the dynamics between the different components ex situ and in situ.;온실가스 증가로 인한 기후변화는 지구생태계를 위협하는 전지구적 환경문제로 대두되고 있다. 전 지구적 기후변화를 야기하는 대표적인 온실가스는 이산화탄소 (CO₂), 메탄 (CH₄), 아산화질소 (N₂O), F-가스 (HFCs, PFCs, SF_(6)), 그리고 휘발성 유기화합물 (VOCs) 등을 칭한다. 본 연구에서는 대표적인 온실가스인 메탄과 VOCs의 분해 특성을 알아보았고, 여러 물질이 혼합하여 존재할 때 각 물질의 상호작용에 대해 조사하였다. 따라서, 본 연구의 목적은 크게 세가지로 볼 수 있으며, 첫째는 메탄과 VOCs의 분해 특성을 알아 보는 것이며, 둘째는 메탄과 VOCs, 또는 여러 VOCs 물질이 공존할 때 각 물질의 생분해에 미치는 기질상호작용을 알아 보는 것이며, 마지막으로 실제 오염가스 배출현장을 모사하여 배출 현장에서 발생할 수 있는 다양한 상황이 오염가스의 제거 효율 및 미생물 활성에 미치는 영향을 알아보는 것이다. 매립지 복토 A, 매립지 복토 B, 강가 습지, 그리고 산림토양을 접종원으로 하여 메탄 분해 혼합균주, 벤젠과 톨루엔 분해 혼합균주, 그리고 메탄, 벤젠, 그리고 톨루엔을 모두 분해하는 혼합균주를 농화배양하였다. 매립지 복토 A, 매립지 복토 B, 강가 습지 토양으로 농화배양한 혼합균주는 메탄을 분해하였지만, 산림토양으로 농화배양한 혼합균주는 분해하지 못했다. 메탄 분해 혼합균주의 메탄 비분해 속도는 접종원에 관계없이 비슷했지만, 메탄, 벤젠 그리고 톨루엔을 모두 분해할 수 있는 혼합균주의 메탄 비분해 속도 보다는 높았다 (강가 습지 제외). 메탄과 달리 모든 농화배양 혼합균주는 벤젠과 톨루엔을 분해하였는데, 벤젠과 톨루엔 분해 혼합균주의 벤젠 톨루엔 분해속도는 매립지 복토 A와 B가 강가 습지와 산림토양보다 높았다. 매립지 복토로 농화배양된 메탄산화 혼합균주와 벤젠 산화 혼합균주의 메탄과 벤젠 산화에 미치는 각 물질의 기질 상호작용을 조사하였다. 메탄산화 혼합균주는 메탄과 벤젠을 모두 산화하였는데, 이는 이 혼합균주에 메탄산화세균뿐 아니라 벤젠 산화에 관여하는 세균이 같이 존재하기 때문이다. 반면에 벤젠 산화세균은 메탄은 산화하지 못하고 벤젠만 산화하였다. 메탄산화 혼합균주의 메탄과 벤젠 산화속도는 메탄:벤젠의 몰비가 증가할수록 유의하게 감소하였다. 하지만, 벤젠 산화 혼합균주의 벤젠 산화속도는 메탄의 공존 및 벤젠:메탄의 몰비 증가에 영향을 받지 않았다. 유류오염토양으로부터 cyclohexane 분해 능이 우수한 Rhodococcus sp. EC1을 분리하였다. EC1은 cyclohexane 뿐 아니라 hexane도 분해할 수 있었는데, EC1은 hexane의 40%를 CO₂로 무기화하였고, 53%는 biomass로 전환하였다. 또한, EC1은 methanol, ethanol, acetone, methyl tert-butyl ether, pyrene, diesel, lubricant oil, benzene, toluene, ethylbenzene, m-xylene, p-xylene, 그리고 o-xylene을 포함하여 다른 탄화수소 화합물을 이용할 수 있었다. Hexane 분해 혼합균주로부터 다양한 탄화수소 (alcohols, chlorinated hydrocarbons, cyclic alkanes, ethers, ketones, monoaromatic과 polyaromatic hydrocarbons, 그리고 petroleum hydrocarbons)를 분해할 수 있는 새로운 세균인 EH831을 분리하였다. EH831의 호기적 hexane 분해 경로를 정성적으로 분석한 결과, EH831은 hexane을 2-hexanol, 2-hexanone, 5-hexen-2-one and 2, 5-hexanedione으로 분해한 후, 4-methyl-2-pentanone, 3-methly-1-butanol, 3-methyl-1-butanone, butanal으로 분해하였고, 최종적으로 CO₂로 분해하였다. Benzene, toluene, ethylbenzene, xylene, 그리고 methyl tert-butyl ether (BTEXM) 를 모두 분해할 수 있는 균주인 Rhodococcus sp. EH831을 이용하여 BTEXM의 이성분, 삼성분, 사성분, 오성분 혼합조건에서의 분해 특성을 조사하였다. 이성분, 삼성분, 사성분, 그리고 오성분 혼합 실험에서, ethylbenzene은 다른 기질 분해에 가장 크게 저해하였고, methyl tert-butyl ether는 가장 적게 저해하였다. Rhodococcus sp. EH831을 접종한 polyurethane biofilter를 대상으로 transient loading (조업정지, 간헐적 조업, 그리고 변동 조업 등)이 biofilter의 운행에 미치는 영향을 조사하였다. Biofilter가 2주의 조업정지 (깨끗한 공기와 물 모두 공급 안함) 후 재가동하였을 때, 1 일의 재적응 후에 benzene과 toluene의 제거능이 빠르게 회복되었다. 정량적 실시간 PCR 결과 (Quantitative real-time PCR), Rhodococcus sp. EH831은 다양한 조업 환경에서도 transient loading동안 10^(10) 에서 10^(11) CFU·g-dry PU^(-1)으로 유지되었다. 본 연구로부터, 메탄, benzene, 그리고 toluene 동시분해 혼합균주, Rhodococcus spp. EC1과 EH831은 난분해성 탄화수소화합물을 포함하여 다양한 VOCs 제거에 유용한 생물학적 자원임을 알 수 있었다. 또한, 본 연구결과는 in situ 그리고 ex situ의 기작 및 dynamics를 예측하고 bioremediation 기법 개발에 도움을 줄 것으로 사료된다.