Comparison in the yield of fetal nucleated RBC between the first- and second- trimester using double density gradient centrifugation

Abstract

산전 유전진단에 이용되고 있는 진단법인 융모막생검, 양수천자 및 제대혈천자는 모두 침습적인 방법으로 산모와 태아에게 유산의 위험성을 가지고 있다. 또한 초기 및 중기 기형아 검사는 정확도가 60% 정도이며 성염색체 이상 진단은 적합하지 않다는 단점이 있다. 이것을 보완하기 위해 모체의 혈액 내에 존재하는 태아의 유핵적혈구를 이용한 비침습적인 산전 진단법이 시도되고 있으나 태아 유핵적혈구는 모체 혈액에 미량으로 존재하기 때문에 진단에 활용하는데 어려움이 있다. 본 연구에서는 임신 주수 (초기: 7주~14주, 중기: 15주~23주)에 따른 태아 유핵적혈구의 회수율을 상대적으로 비교하기 위해 80명의 산모 혈액을 가지고 double density gradient 방법을 시행하였다. Mini MACS로 유핵적혈구를 회수한 후 K-B staining을 하여 형태학적으로 유핵적혈구를 확인한 후 태아세포임을 알기 위하여 CEP X와 CEP Y probe를 이용하여 FISH를 시행하여 유핵적혈구의 성별 확인을 통해 태아 기원 유무를 확인하였다. 산모의 혈액에서 분리한 K-B positive한 유핵적혈구 수는 초기 임신은 11.42 (±13.22)개였으며, 중기 임신은 16.56 (±14.61)개로 임신 중기에 회수된 유핵적혈구의 수가 많았지만 통계학적 유의성을 나타나지 않았다. 또한 융모막검사와 양수검사 결과를 확인한 모든 샘플에 FISH signal을 확인할 수 있었으며, 남아를 임신한 산모에서 분리한 임신초기와 중기 태아 유핵적혈구는 각각 69.31%와 59.8%로 통계학적 유의성을 없었으나 초기임신에서 태아세포 회수율이 높은 점에서 주목 할 만하며, 임신초기 혈액에서의 비침습적인 산전진단의 가능성을 높일 수 있을 것으로 사료된다.;Prenatal diagnosis tests using invasive diagnostic and screening techniques such as amniocentesis and chorionic villus sampling are known to be dangerous to the living fetus during the pregnancy. The maternal serum tests can be an alternative choice for non-invasive technique, but it has low sensitivity and cannot confirm sex chromosomal abnormalities. Prenatal diagnosis tests using the fetal nucleated RBCs in maternal circulation has been studied to overcome this shortage. Yet, the researchers must face the difficulties in practical application because the number of fetal RBCs in maternal blood is relatively very small. Nonetheless, it is a necessary diagnostic method in the first- and second- trimester of pregnancy for higher risk groups with possible genetic abnormalities. Therefore, this study was carried out to make the comparison in the maximum number of fetal nRBCs obtained between the first- and second- trimester. We tried to collect nRBCs from maternal blood by double gradient centrifugation and magnetic activating cell sorting. Then, Kleihauer-Betke staining was performed and Fluorescent in situ hybridization (FISH) analysis with CEP X and CEP Y probes for K-B positive nRBCs was performed to detect whether fetal cells were present among nRBCs by observation of sex chromosomes. The average number of K-B positive nucleated RBCs separated from maternal blood was 11.42±13.22 in 7 to 14 gestational weeks and 16.56±14.61 in 15 to 23 gestational weeks, but there was no statistical significance. Nucleated fetal RBCs separated from pregnant women with male fetuses, confirmed by amniocentesis or chorionic villus sampling, were identified by FISH. As a result, FISH signals detected in the first- and second- trimester of pregnancy were 69.31% and 59.8%, respectively. These results indicate that the prenatal diagnosis tests using fetal nRBC in the first- and second- trimester of pregnancy has a potential to be more useful than other maternal serum screening tests. Further studies are needed to solve the contamination of the maternal mononuclear cells and the fetal nRBCs.