흰 쥐 배양 해마절편의 산소 포도당 결핍/재관류에서 에스트로겐이 IL-1β와 IL-1 receptor antagonist의 발현에 미치는 영향

Abstract

뇌 허혈은 일시적인 또는 영구적인 뇌 혈류 감소의 결과로 발생한다. 뇌 허혈 손상에는 1차 손상과 2차 손상이 있으며, 손상 후 수 시간에서 수 일 동안 발생하는 2차 뇌 신경세포 손상은 염증과 자가 세포 사멸 등에 의해 유도된다. 뇌 허혈은 tumour necrosis factor α (TNFα) 와 Interleukin-1 (IL-1)β 같은 염증 관련 인자의 발현을 유도하며, IL-1β는 주요한 염증관련 단백질로, 2차 손상에 관여한다. IL-1 receptor antagonist (IL-1ra)는 IL-1β 수용체의 경쟁적인 길항제로 염증성 반응을 봉쇄하는 내인성 항염증 물질로써 작용한다. 이와 같은 사실로, IL-1β와 IL-1ra의 발현 조절이 뇌 허혈 손상에 중요하게 작용하리라 생각된다. 에스트로겐의 뇌 세포보호 작용은 여러 논문을 통해 연구되었다. 에스트로겐의 뇌 세포보호 효과는 다양한 기전을 통해 나타나며, 항염증 효과는 이 기전의 하나로 작용한다. 하지만, 에스트로겐의 IL-1β/IL-1ra의 발현 비율 변동을 통한 항염증 효과에 대해서는 연구된 바가 없다. 본 연구에서는 뇌졸중에서 에스트로겐의 IL-1β/IL-1ra 발현 비율 변동을 통해 나타나는 항염증 효과에 대해 규명하고자 하였다. 10 일된 흰 쥐의 배양 해마 절편을 이용하여, 산소 포도당 결핍을 30분간 유도 한 후 6 시간, 24시간 또는 72시간 동안 재관류를 유도 하였고, 산소 포도당 결핍 7일 전 에스트로겐(17β-estradiol, E2)을 1 nM로 처치하였다. Propidium iodide 형광 염색으로 신경세포 손상을 측정 하였고, RT-PCR, real-time PCR, Westrn blot을 통해 IL-1β와 IL-1ra의 발현을 측정하였다. 신경세포 손상은 산소 포도당 결핍군의 피라미드형 세포층 CA1 부위에서 대조군에 비해 시간에 의존적으로 유의하게 증가하였고, 이 증가는 재관류 24시간과 72시간에서 에스트로겐 전처리시 유의하게 감소하였다. IL-1β mRNA 발현이 산소 포도당 결핍군에서 재관류 6시간에 가장 높게 나타났으며, 재관류 시간에 따라 점차 감소하였다. 에스트로겐 전처리시 IL-1β mRNA 발현이 재관류 24시간에서 산소 포도당 결핍군에 비해 유의하게 감소하였다. IL-1ra mRNA의 발현은 산소 포도당 결핍군에서 대조군에 비해 증가하였으며, 에스트로겐 전처리시 재관류 72시간까지 그 증가가 더 증대되었다. IL-1β/IL-1ra mRNA 비율은 산소 포도당 결핍군에서 재관류 6시간에 가장 증가하였으며, 그 증가는 에스트로겐 전처리에 의해 감소하였다. 재관류 24시간에서 IL-1β/IL-1ra mRNA 비율의 감소 효과는 통계적으로 유의하였다. 산소 포도당 결핍군의 IL-1β 단백질 발현이 대조군에 비해 유의하게 증가하였으며, 그 증가는 에스트로겐 전처리에 의해 재관류 6시간과 24시간에서 유의하게 감소하였다. IL-1ra 단백질 발현은 에스트로겐 전처리에 의해 재관류 6시간과 24시간에서 산소 포도당 결핍군에 비해 증가하였고, 재관류 24시간에서 유의한 차이를 보였다. IL-1β/IL-1ra 단백질 비율은 재관류 6시간과 24시간에서 산소 포도당 결핍군이 대조군에 비해 유의하게 증가되었으며, 그 증가는 에스트로겐 전처리에 의해 유의하게 감소하였다. 이상의 결과를 통해, 에스트로겐에 의한 IL-1β/IL-1ra mRNA와 단백질 발현 비율 변동이 항염증 작용에 부분적으로 관여하리라 생각된다.;Ischemia induces expression of inflammatory cytokines, such as tumor necrosis factor (TNF)α and interleukin-1 (IL-1)β. IL-1β is a potent proinflammatory cytokine, and IL-1 receptor antagonist (IL-1ra), an endogenous competitive antagonist of IL-1 receptors, counteracts the pro-inflammatory responses to IL-1β. Thus regulation of IL-1β and IL-1ra expression may play a role in the ischemic stroke injury. Neuroprotective effects of estrogen were occurred via many mechanisms, including anti-inflammatory effect. However, it is not clearly defined how estrogen exerts anti-inflammatoin effects through modulation of the balance between IL-1β and IL-1ra. This study was performed using cultured hippocampal slices, to evaluate how estrogen exerts anti-inflammatoin effects through modulation of IL-1β/IL-1ra ratio in ischemic stroke. Oxygen-glucose deprivation (OGD) was induced 30minutes and then reperfused for 6, 24, 72 h. Estrogen (17β-estradiol, E2) was treated for 7days before OGD. Neuronal cell damage was detected by propidium iodide fluorescence (PI) staining. Expressions of IL-1β and IL-1ra were measured by RT PCR, real-time PCR and Western blot. Neuronal damage was significantly increased according to reperfusion time in CA1 area of OGD group compared to control, and this increase was significantly reduced by E2 pretreatment at 24 h and 72 h after reperfusion. IL-1β mRNA expression was markedly increased by OGD group, and this increase was significantly reduced by E2 pretreatment at 24 h after reperfusion. Expression of IL-1ra mRNA was increased by OGD group, and the increase was markedly enhanced by E2 pretreatment up to 72 h reperfusion. The ratio of IL-1β/IL-1ra mRNA was markedly increased by OGD group and this increase was reduced by E2 pretreatment at 24 h after reperfusion. IL-1β protein was significantly increased in OGD group compared to control, and this increase was significantly reduced by E2 pretreatment at 6 h and 24 h after reperfusion. And at 24 h after reperfusion, IL-1ra protein was significantly increased in E2 pretreatment group compared to OGD. The ratio of IL-1β/IL-1ra protein was significantly increased by OGD group, and this increase was significantly reduced by E2 pretreatment group at 6 h and 24 h after reperfusion. These results suggest that modulation of the balance between IL-1β/IL-1ra mRNA and protein may be associated with anti-inflammatory mechanisms of estrogen, in part.