Inhibition of MMP-3 or -9 suppresses α-synuclein-induced expression of proinflammatory cytokines and iNOS in primary cultured microglia

Abstract

α-Synuclein is a small soluble protein (14 kDa) that is abundant in neurons, especially at the presynaptic terminals. When mutated or overexpressed, the synuclein protein aggregates and produces Lewy bodies that are implicated in the pathogenesis of neurodegenerative diseases such as Parkinson’s disease (PD), dementia with Lewy bodies (DLB), and multiple system atrophy (MSA). Despite there being a great deal of work on how Lewy bodies damage dopaminergic neurons, only a few clear principles have been established. Matrix metalloproteinases (MMPs) are zinc-dependent endopeptidases that are associated with various physiological processes involving both beneficial and detrimental effects. Abnormally expressed MMPs induce inflammation and neuropathological conditions in the central nervous system. However, the role of MMPs in microglia remains unclear. In the present study, I found that extracellularly applied α-synuclein induced microglia activation in primary cultured microglia. α-Synuclein induced the expression of proinflammatory cytokines and iNOS at protein and mRNA level. Furthermore, α-synuclein induced expression of MMP-1, -3, and -9. To determine the role of MMPs in α-synuclein-induced microglial activation, the effects of MMP inhibitors on various inflammatory molecules were examined. It was found that inhibition of MMP-3 or -9 significantly suppressed the expression of proinflammatory cytokines and iNOS in α-synuclein-stimulated microglia. MMP-3 and MMP-9 inhibitors also suppressed the activities of MAPK, NF-κB and AP-1, which are important upstream signaling molecules in microglial activation. In order to investigate the pathway that α-synuclein generates inflammatory signals in microglial cells, primary microglia were treated with PAR-1-specific inhibitors before stimulation with α-synuclein. As a result, PAR-1 inhibitors significantly reduced cytokines, NO, and ROS production. Taken together, the results suggest that MMP-3 and MMP-9 play a pivotal role in α-synuclein-induced microglial activation, and PAR-1 may be involved in this regulation.;α-synuclein은 신경세포에 풍부하게 존재하는 14 kDa의 작은 수용성 단백질로, 특히 전시냅스 말단(presynaptic terminal)에 존재한다. synuclein 단백질은 돌연변이가 일어나거나 과도하게 발현 되었을 경우, 응축되어, Lewy body를 형성함으로써, 파킨슨병(PD)이나 Lewy body를 나타내는 치매(DLB), 다발신경계 위축증(MSA)과 같은 퇴행성 뇌 질환의 발병을 유도하는 것으로 알려져 있다. 지금까지 α-synuclein에 의해 생성된 Lewy body가 어떻게 도파민성 신경세포에 손상을 입히는 지에 대한 많은 연구에도 불구하고, 명확한 원리는 밝혀지지 않고 있다. Matrix metalloproteinases (MMPs)는 아연 의존적인 단백질 분해효소로서, 다양한 생리적인 과정에서 유익한 효과와 해로운 효과를 함께 나타내는 것으로 알려져 있다. 중추 신경계에서 비정상적으로 발현된 MMP는 염증 반응과 신경 병리적인 상황을 유발한다. 그러나 소교세포에서 이 같은 MMP의 역할에 대한 연구는 부족한 상태이다. 본 연구에서는 일차배양 소교세포에 α-synuclein을 처리시, 염증성 cytokine 및 iNOS의 발현이 유도되는 것을 단백질과 mRNA 수준에서 보임으로써, α-synuclein이 소교세포 활성화를 유발한다는 것을 증명하였다. 또한, α-synuclein은 MMP-1, -3, -9의 발현을 유도하였다. α-synuclein에 의한 소교세포 활성화에 있어서 MMP의 역할을 알아보기 위해, MMP 억제제를 이용하여 다양한 염증성 분자들에 미치는 효과를 살펴 보았다. 그 결과, α-synuclein에 의해 활성화된 소교세포에서 MMP-3 또는 -9을 억제했을 경우, 염증성 cytokine과 iNOS의 생성이 감소되는 것을 알 수 있었다. 뿐만 아니라, MMP-3 또는 MMP-9 억제제에 의해 소교세포의 활성화에 중요한 상위 신호전달분자인 MAP kinases, NF-κB와 AP-1의 활성을 억제됨을 보였다. 나아가 소교세포에서 α-synuclein이 염증성 신호들을 생성하는 경로를 알아보기 위해 α-synuclein에 의해 자극을 주기 전에PAR-1에 특이적인 억제제를 일차배양 소교세포에 처리하였다. 그 결과 PAR-1 억제제는 cytokine과 NO (nitric oxide), 활성 산소의 생성을 크게 감소 시켰다. 이 같은 결과를 통하여 MMP-3와 MMP-9은 α-synuclein에 의한 소교세포 활성화에 중요한 역할을 하며, 이러한 조절 과정에 PAR-1이 관여할 것으로 사료된다.